高效液相色谱法分离饮料中的糖精钠

司晓喜，董岳峰，杨 怡，张雪花，赵 杨，刘志华，李振杰，许志刚*

(1.云南烟草化学重点实验室，云南中烟工业有限责任公司技术中心，云南 昆明 650231；2. 昆明理工大学 理学院，云南 昆明 650500)

0 引言

糖精钠是一种常用于食品工业的人造甜味剂，具有悠久的使用历史，但它也是最具争议的合成甜味剂之一。它可使人食欲减退、低龄人群长期食用导致营养不良、短期大量使用还可能引发中毒等[1-2]。在我国食品添加剂使用标准中(GB 2760-2014)，对食品中糖精钠的使用量进行了限制，食品中糖精钠的添加量的范围在0.15～5.0 g/kg之间[3]。未按照国家标准使用，或滥用，亦或者食品制造商隐瞒消费者擅自以糖精钠作为替代品添加到食物中，都有极大可能对人体健康造成损害，尤其是正处于生长发育期的青少年。

食品安全国家标准GB 5009.28-2016[4]中详细介绍了包括糖精钠在内的3种食品添加剂的测定方法，有液相色谱法和气相色谱法。另外，还有文献报道了其他类型的检测方法，如薄层色谱法[5]、离子选择电极测定法[6]、滴定法[7]、HPLC-MS联用[8]、分光光度法[9]等方法。其中最普遍、使用最广泛的方法是高效液相色谱法，该方法具有简单快速准确等优点[10-13]。本文采用高效液相色谱法对糖精钠进行测定，并对色谱分离条件进行了优化，所建立的分析方法能有效测定饮料中糖精钠的含量。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Dionex Ultimate 3000高效液相色谱仪(美国戴安公司)，配备DAD检测器、自动进样器；YMC-Pack CN色谱柱(250 mm×4.6 mmI.D.，S-5 μm，12 μm，YMC公司)；Innoval Neo XD C18色谱柱(250 mm×4.6 mmI.D.，5 μm，天津博纳艾杰尔公司)；HILIC色谱柱(150 mm×4.6 mmI.D.，5 μm，天津博纳艾杰尔公司)；PS-10A超声波清洗机(深圳市洁康洗净电器有限公司)。

乙酸铵(98%，西陇化工股份有限公司)；乙腈(色谱纯，萨恩化学技术有限公司)；糖精钠(98%，阿拉丁试剂上海公司)；实验用水均为娃哈哈纯净水；饮料样品购于昆明当地超市。

1.2 实验方法

1.2.1 样品前处理方法

准确移取实际样品100 μL于比色管中(汽水样品需经过超声脱气)，用纯水稀释定容至10 mL，超声混合均匀10 min后，用5 mL注射器吸取一定量溶液，经0.22 μm水系滤膜过滤后装入液相小瓶，通过高效液相色谱仪进样测定。每组样品平行测定3份。

1.2.2 标准溶液的配制

准确称取0.05 g的糖精钠标准品，置于50 mL比色管中，以纯水为溶剂，配置成浓度为1 000 mg/L的母液。采用逐级稀释法配制成浓度为0.01 mg/L，0.05 mg/L，0.1 mg/L，0.5 mg/L，1.0 mg/L，2.0 mg/L，5.0 mg/L，10 mg/L和20 mg/L的标准溶液，通过高效液相色谱仪进行定量分析。

1.2.3 色谱分析方法

采用Dionex Ultimate 3000高效液相色谱仪检测糖精钠，流动相为乙腈-0.02 mol/L乙酸铵溶液，检测波长为230 nm，进样量为20 μL，对色谱柱的类型、流动相的配比，流速和柱温等色谱条件进行优化。在最佳色谱条件下测定实际样品中糖精钠的含量，并进一步进行加标回收试验，加标浓度分别为0.5 mg/L、5.0 mg/L、15 mg/L，计算其加标回收率和相对标准偏差。

2 实验结果与讨论

2.1 色谱条件的优化

2.1.1 色谱柱的选择

C18柱、HILIC柱和CN柱均对糖精钠有一定的分离能力，分别采用3种类型的色谱柱对糖精钠进行分离测定。结果如图1所示，糖精钠在C18柱上的色谱峰型出现严重拖尾现象，而在HILIC柱和CN柱上可以得到较好的色谱峰型，但糖精钠在HILIC柱上出峰时间过早，与溶剂峰非常接近。而在CN柱上可以得到一个较合适的保留时间和较好的色谱峰型。因此，采用CN柱进行色谱分析。

图1 不同色谱柱对糖精钠的分离效果的色谱图

2.1.2 流动相配比的优化

糖精钠极性较强，在CN柱上保留效果较强，且保留时间合适。当流动相中乙腈和0.02 mol/L乙酸铵溶液的比例由20∶80(V∶V)向5∶95(V∶V)逐渐变化时，结果如图2所示，出峰时间不断增大，整体峰展宽也逐渐增大，但目标峰峰面积变化不大。在流动相比例为15∶85(V∶V)时，色谱峰型最好，出峰时间适中，目标峰与溶剂杂峰有较好的分离。因此，选择流动相中乙腈-0.02 mol/L乙酸铵溶液的比例为15∶85(V∶V)。

图2 流动相配比对糖精钠分离影响的色谱图

2.1.3 流速的优化

在CN色谱柱下，以比例为15∶85(V∶V)的乙腈-0.02 mol/L乙酸铵溶液为最佳流动相，探究流速对糖精钠分离的影响。结果如表1和图3所示，当流速由0.4 mL/min向0.9 mL/min变化时，出峰时间不断提前，峰面积不断减小，峰展宽也不断减小，但柱压随流速的增大而逐渐增大。在流速为0.6 mL/min时，峰面积较大，出峰时间适中，峰展宽较小，且柱压适中。因此，选择0.6 mL/min为最佳流速。

表1 流速对糖精钠分离的影响

图3 流速对糖精钠分离影响的色谱图

2.1.4 柱温的优化

在以上最优条件下，进一步进行柱温的优化。考虑到CN柱的使用环境，以20 ℃为最低温度，柱温由20 ℃向35 ℃变化。结果如图4所示，在不同温度下出峰时间变化不大，峰面积变化也不大，但峰展宽随温度升高先减小后增大，柱压随柱温的升高而逐渐减小。当柱温为25 ℃时，色谱峰型较好，峰展宽较小。因此，选择25 ℃为最佳色谱柱温。

图4 柱温对糖精钠分离影响的色谱图

2.2 线性方程、检出限、定量限

采用逐级稀释法配制了一系列浓度梯度的标准溶液。通过高效液相色谱仪进行定量分析。以糖精钠的浓度(mg/L)为横坐标，峰面积(mAU)为纵坐标绘制出标准曲线。标准曲线的线性方程为Y=0.80X+0.33，r=0.999 79，糖精钠在0.01～20 mg/L范围内线性关系良好。检出限(S/N=3)为0.003 3 mg/L，定量限(S/N=10)为0.010 mg/L。

2.3 实际样品分析及加标回收实验

对从市面上随机购买的4种饮料进行分析检测，先按照1.2.1的实际样品前处理方法进行样品处理，再通过高效液相色谱进样检测，结果如表2所示，在4种饮料中均检出了糖精钠，检出浓度在1.68～20.25 mg/L之间。

表2 实际样品中糖精钠的含量及加标回收率(n=3)

为了进一步验证方法的适用性，在上述样品分析的基础上进行加标回收实验。在饮料样品中添加一定量的糖精钠标准溶液，样品的加标浓度分别为0.5 mg/L、5 mg/L、15 mg/L，平行测定3组。实际样品分析色谱图如图5所示，目标峰与杂质干扰峰有较好的分离，且分析时间短、效率高。扣除本底值后的加标回收率在70.37%～124.10%之间，相对标准偏差(RSD)在0.19%～9.39%之间。

图5 实际样品色谱图

3 结论

糖精钠是一种人造甜味剂，对人体无营养价值。当食用较多时，会影响肠胃消化酶的正常分泌，降低小肠的吸收能力，使人食欲减退。许多国家都限制了糖精钠在食品加工中的使用量。但在生产经营活动中，少数企业为了片面追求产品的甜度、色泽或延长产品保质期，擅自违法过量使用糖精钠等食品添加剂，对人体健康构成了潜在的威胁。本文采用高效液相色谱法测定不同饮料中的糖精钠，测得饮料中糖精钠的浓度在1.68～20.25 mg/L之间，所测饮料中糖精钠的含量均符合国家食品添加剂使用标准。