HPLC-DAD法同时测定依托泊苷注射液中3个成分的含量

陈秋竹，黄春青，曹桂红，何劼毅

(贵州省食品药品检验所，贵州 贵阳 550004)

0 引言

依托泊苷注射液为无色至淡黄色澄明液体，主要成份为依托泊苷。依托泊昔注射液由北京制药工业研究所于20世纪70年代后期研究成功，依托泊苷(Etoposide,ETP)是植物成分鬼臼毒素的糖代谢衍生物[1]，是一种广泛应用的拓扑异构酶抑制剂类化疗药物[2]，主要用于治疗小细胞肺癌[3]、恶性淋巴瘤[4]、恶性生殖细胞瘤[5]、白血病[6-7]，对神经母细胞瘤[8]、横纹肌肉瘤[9]、卵巢癌[10]、非小细胞肺癌[11]、胃癌[12]和食管癌[13]等也有一定疗效。依托泊苷注射液现收载于中国药典2020年版二部[14]，美国药典及欧洲药典均对原料药有收载[15-16]。贵州省食品药品检验所承担了2013年依托泊苷注射液的评价性抽验工作，在检验及探索性研究中发现质量标准存在问题，现行标准含量测定采用的色谱条件会使依托泊苷主峰和注射剂辅料苯甲醇的降解产物苯甲醛重合，导致依托泊苷含量增加，给样品的质量评价带来偏差。

本文采用的梯度洗脱方法能把测定依托泊苷、苯甲醇、苯甲醛峰较好地分开，能准确测定各自含量，真实反映依托泊苷的实际含量，对依托泊苷注射液的含量测定、辅料用量及药品质量提供较好地参考依据。

1 仪器与试剂

Thermo U3000 高效液相色谱仪；Waters X-Bridge C18色谱柱 (4.6 mm×250 mm，5 μm)；Mettler TOLEDO XS205型精密电子天平。依托泊苷对照品(中国食品药品检定研究院，批号100388-200401，含量以97.4%计)、苯甲醇对照品(中国食品药品检定研究院，批号190019-201301，含量以99.8%计)、苯甲醛对照品(中国食品药品检定研究院，批号111650-200802 ，含量以99.7%计)。依托泊苷注射液共17批，来自2家生产企业，均为国家评价性抽验样品(标示量为2 mL∶40 mg)。乙腈(色谱纯，生产厂家：美国天地有限公司)、无水甲酸(分析纯，生产厂家：天津市福晨化学试剂厂)、三乙胺(色谱纯，生产厂家：西亚化学科技(山东)有限公司)，水为Milli-Q纯水机制备。

2 实验部分

2.1 色谱条件与系统适用性试验

色谱条件：采用 C184.6 mm×250 mm色谱柱，以无水甲酸-三乙胺-水(1∶1∶998，V∶V∶V)为流动相A，无水甲酸-三乙胺-乙腈(1∶1∶998，V∶V∶V)为流动相B，梯度洗脱(0～15 min，80%A；15～30 min，80%→56%A；30～40 min，56%A；40～42 min，56%→40%A；42～45 min，40%A；45～47 min，40%→80%A；47～50 min，80%A)，流速控制为1.0 mL/min，检测波长λ=254 nm，柱温为35 ℃，进样体积为20 μL。

系统适用性试验：依托泊苷、苯甲醇、苯甲醛的理论板数均应不低于3 000，分离度均应大于1.5(见图1)。

图1 液相色谱图

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液

精密称取依托泊苷、苯甲醇、苯甲醛对照品各适量，用混合溶剂(流动相A-流动相B(80∶20))溶解并稀释制成每1 mL中各含浓度为0.204 15 mg、0.244 79 mg、0.004 59 mg的溶液，分别作为依托泊苷、苯甲醇、苯甲醛的对照品溶液，即得。

2.2.2 供试品溶液

精密量取本品1 mL，置100 mL量瓶中，用混合溶剂稀释制成每1 mL中含0.2 mg的溶液，即得。

3 方法学验证

3.1 线性方程

3.1.1 依托泊苷线性关系

精密称取依托泊苷对照品10.48 mg，置50 mL容量瓶中，用流动相A-流动相B(80∶20)的混合溶剂稀释至刻度，摇匀，精密吸取5 mL分别置100 mL、50 mL、25 mL、10 mL容量瓶中，加混合溶剂至刻度，摇匀，作为线性1、线性2、线性3、线性4溶液，母液作为线性5溶液；再精密称取依托泊苷对照品21.39 mg，置10 mL容量瓶中，用混合溶剂稀释至刻度，摇匀，精密吸取2 mL置5 mL、容量瓶中，加混合溶剂至刻度，摇匀，作为线性6溶液。分别精密吸取上述6种溶液各20 μL注入液相色谱仪，记录色谱图，以峰面积为纵坐标，进样量为横坐标，绘制标准曲线(见表1、图2)。

3.1.2 苯甲醇线性关系

精密称取苯甲醇对照品10.22 mg，置25 mL容量瓶中，用流动相A-流动相B(80∶20)的混合溶剂稀释至刻度，摇匀，作为母液。精密量取母液1 mL分别置25 mL、10 mL、5 mL容量瓶中，加混合溶剂稀释至刻度，摇匀，作为线性1、线性2、线性3溶液，再精密量取母液3 mL置10 mL和5 mL容量瓶中，加混合溶剂稀释至刻度，摇匀，作为线性4和线性5溶液，母液作为线性6溶液。分别精密吸取上述6种溶液各20 μL注入液相色谱仪，记录色谱图，以峰面积为纵坐标，进样量为横坐标，绘制标准曲线(见表1、图2)。

3.1.3 苯甲醛线性关系

精密吸取苯甲醛对照品溶液(0.114 85 mg/mL)1 mL分别至10 mL、25 mL、100 mL量瓶中，用流动相A-流动相B(80∶20)的混合溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为线性4、线性5、线性6溶液，再精密吸取线性4溶液5 mL分别置50 mL、25 mL、10 mL量瓶中,用流动相A-流动相B(80∶20)的混合溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为线性1、线性2、线性3溶液。分别精密吸取上述6种溶液各20 μL注入液相色谱仪，记录色谱图，以峰面积为纵坐标，进样量为横坐标，绘制标准曲线(见表1、图2)。

表1 3个成分的回归方程及线性范围

图2 依托泊苷(A)、苯甲醇(B)和苯甲醛(C)标准曲线

3.2 检出下限和定量下限

将“3.1.1”项下的3种对照品的线性储备溶液稀释至不同浓度，进样测定，以信噪比3∶1为检测限(LOD)、10∶1为定量限(LOQ)，测定结果见表1。

3.3 精密度试验

取“3.1.1”项下的依托泊苷、苯甲醇、苯甲醛对照品溶液各连续进样6次，依托泊苷、苯甲醇及苯甲醛峰面积平均值分别为28.41、4.76、7.40，RSD值分别为0.4%、0.6%和0.9%，表明方法精密度良好(见表2)。

表2 精密度测定结果表

3.4 重复性试验

精密量取同一批号的依托泊苷注射液6份各1 mL，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，测得依托泊苷、苯甲醇及苯甲醛的含量平均值分别为20.03 mg/mL、27.85 mg/mL、0.033 1 mg/mL，RSD分别为0.3%、0.2%、1.7%，表明方法重复性良好(见表3)。

表3 重复性测定结果表

3.5 稳定性试液

取“3.4”项下同一供试品溶液，分别于0 h、6 h、12 h、18 h测得峰面积，结果依托泊苷、苯甲醇、苯甲醛峰面积的RSD分别为0.3%、0.3%、0.6%，表明供试品溶液12 h内稳定性良好(见表4)。

表4 稳定性结果表

3.6 回收率试验

精密吸取依托泊苷注射液样品1 mL，共18份，精密加入依托泊苷、苯甲醇、苯甲醛质量浓度分别为1.425 9 mg/mL、1.996 5 mg/mL、0.002 55 mg/mL的对照品溶液各15 mL，按“2.2.2”项下的方法平行制得依托泊苷、苯甲醇、苯甲醛的回收率试验溶液各6份，进样测定，结果依托泊苷、苯甲醇、苯甲醛的平均回收率分别为99.9%、100.7%、98.8%，RSD为0.7%、1.1%、3.4%(见表5)。

表5 加标回收率试验结果(n=6)

3.7 样品测定

取17批依托泊苷注射液样品，分别按“2.2.2”项下的方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，以外标法计算含量，结果见表6。

表6 依托泊苷注射液中3个成分的含量测定结果

4 讨论与分析

依托泊苷注射液现行质量标准收载于《中国药典》2020年版二部，采用苯基柱，以乙腈-醋酸盐缓冲液(pH 4.0)(30∶70)为流动相等度洗脱，该方法使苯甲醛峰与依托泊苷峰无法分开，出现包裹现象，导致依托泊苷含量偏高，其苯甲醛是制剂辅料苯甲醇氧化后的产物[17]，现行含量测定方法使得添加了苯甲醇辅料的某些厂家生产的依托泊苷注射液含量测定值比其真实值偏高。故本文参考《中国药典》和《美国药典》中依托泊苷注射液有关物质项下的色谱条件[14-15]，综合文献报道对依托泊苷有关物质的研究[18-20]，我们对依托泊苷注射液含量测定的色谱条件进行优化，改进了色谱柱和流动相，采用梯度洗脱方法，能将依托泊苷和辅料苯甲醇及其氧化产物苯甲醛分开并定量，使得该品种的含量测定结果更准确和科学。

色谱图中发现苯甲醇对照品含有苯甲醛峰，故本文在测定加标回收率时需分开测定苯甲醇和苯甲醛的回收率。因依托泊苷注射液标准的检测波长为254 nm，该波长同时也是苯甲醛的最大吸收波长，故苯甲醛的响应大。若用药典标准测定含量，使得苯甲醛增加的峰面积被当做依托泊苷峰面积，使得微量的苯甲醛导致较大的依托泊苷含量增加。故我们制定的能将依托泊苷和苯甲醛分开的方法是必要且有意义的。

本实验建立了采用HPLC-DAD同时测定依托泊苷注射液中3个成分含量的方法，该方法准确、可靠、便捷，能准确测定制剂中依托泊苷的含量，剔除辅料及杂质的干扰，为客观评价依托泊苷注射液质量提供了科学依据，具有一定的应用价值和实用意义。