在线超临界流体萃取-超临界流体色谱-串联质谱法快速筛查降糖类中成药及保健品中非法添加五种化学药的方法

董 琨，宫晓平，李晓东，郭彦丽

[1.张家口市食品药品检验中心，河北 张家口 075000；2.岛津企业管理（中国有限公司）创新中心，北京 100020]

0 引言

糖尿病是一种以高血糖为特征的代谢性疾病，在全球发病率有逐年增高的趋势，现已被列为继心血管及肿瘤疾病之后的第三大疾病[1]。高血糖是由胰岛素分泌缺陷或其生物作用受损，或者两者兼有引起的。长期存在高血糖会导致各种组织特别是眼、肾、心脏、血管、神经的慢性损害及功能障碍。随着社会经济的发展，人们的生活水平不断提高，而“绿色食品”理念的提倡和发展，让人们开始越来越重视身体健康和饮食安全，一些调节血糖平衡的中成药和保健品变得日益畅销。一些不法商贩为了提高服用效果和销售口碑，在中成药和保健品中非法添加了具有降糖或辅助降糖效果的化学药，其成分往往是格列本脲、格列美脲、格列齐特等需要在医生的严格指导下才能服用的处方药[2-4]。这种做法不光对消费者的身体造成损害，也严重危害了用药的安全性[5]。消费者如果服用这类的中成药和保健品，不仅会浪费大量资金，还会造成病情延误，引发糖尿病的并发症，甚至有可能会因为过量服用有非法添加物的降糖药而导致患者血糖过低，从而引发昏迷，甚至危及患者的生命安全[6-7]。近年来，检测降糖药物中非法添加物的方法主要为液相色谱-质谱联用法[8-9]，但该方法在实际工作中存在诸多问题，如流动相配制过程复杂，样品处理过程需要使用大量的有机溶剂，试验周期偏长，实验人员接触了大量有机溶剂的同时也造成了环境污染。

针对以上问题，本研究采用在线超临界流体萃取-超临界流体色谱-串联质谱法。超临界流体是指温度和压力（压强）均处于临界点以上时的物质状态，它具有与液体相比，黏度小、扩散系数大，与气体相比，溶解度较大的特点。超临界流体萃取（Supercritical Fluid Extraction，SFE）是使用超临界二氧化碳（温度和压力均处于临界点以上时的二氧化碳）作为萃取溶剂的一种新型萃取分离技术。因为二氧化碳是非极性分子，所以与正己烷等有机溶剂相同，可溶解疏水性化合物，并且可以通过调整压力，使密度发生变化，从而改变溶剂的溶解度，而在萃取时使用甲醇等有机溶剂作为改性剂，将可以改变极性，因此二氧化碳广泛适用于各种化合物的萃取。超临界流体色谱法（Supercritical Fluid Chromatography，SFC）是使用超临界二氧化碳作为流动相的一种色谱分离方法。SFC流动相的黏度小，与高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）相比，即使在流速较大时加长色谱柱，压力上升幅度仍然较小，可以实现超快速和高分离分析；在添加甲醇等具有极性的有机溶剂后，可改变流动相的极性；因为正向分析及反向分析仅取决于色谱柱的修饰基团，所以不必更换流动相，可使用一个系统对应两种分析，简单快捷。

本研究依据超临界流体萃取与超临界流体色谱的特点，开发出中成药及保健品中非法添加5种降糖类化学药的在线超临界流体萃取-超临界流体色谱-串联质谱法的快速筛查方法。与传统检验方法相比，本方法可在一次作业中同时进行萃取和分离，减少预处理的作业量，样品仅需简单粉碎就可以直接上机，利用超临界色谱分离和质谱检测，即可达到快速筛查的目的。

1 仪器与试药

1.1 仪器

本研究使用岛津Nexera UC型在线超临界流体萃取/超临界流体色谱系统串联岛津8060型串联质谱仪（日本岛津公司）；Shim-pack UC-X RP C18色谱柱（150 mm×4.6 mm，3 μm；P/N：227-30501-01；S/N：16L04359）；CPA225D型十万分之一精密电子天平（德国赛多利斯集团）。

1.2 标准品与试剂

本研究使用格列吡嗪（批号：100281-201905；含量：99.9%），格列本脲（批号：100135-201806；含量：99.5%），格列美脲（批号：100674-201904；含量：99.7%），格列喹酮（批号：100280-201403；含量：99.5%），盐酸罗格列酮（批号：100673-201902；含量：93.3%）（均购自中国食品药品检定研究院）；甲醇（色谱纯，美国Fisher Scientific试剂公司）；超临界流体萃取专用滤纸片（Miyazaki Hydro-Protect，批号51105577）（SHIMADZU日本岛津公司）。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

分别精密称取“1.2”项下格列吡嗪、格列本脲、格列美脲、格列喹酮、盐酸罗格列酮对照品10 mg至100 mL容量瓶中，分别加甲醇溶解并稀释至刻度制成每1 mL含约 0.1 mg 的对照品储备液。

2.2 萃取条件

萃取剂：A为超临界二氧化碳，B为含0.1%甲酸的甲醇；萃取剂比例：（92∶8，V/V）；萃取流速：3 mL·min-1，萃取时背压A为14.8 MPa，背压B为15 MPa；萃取温度：40 ℃，采取先静态萃取4 min，再动态萃取3 min的方式进行萃取。

2.3 色谱条件

色谱柱：Shim-pack UC-X RP C18色谱柱（150 mm×4.6 mm，3 μm；P/N：227-30501-01；S/N：16L04359）。流动相：A为超临界二氧化碳，B为含0.1%甲酸的甲醇， 采 用8%B（7～7.5 min）-30%B（11～14 min）-8%B（14.1～17 min）梯度洗脱程序；流速：2 mL·min-1；柱温：40 ℃，洗脱时背压A为15 MPa，背压B为40 MPa。

质谱补偿液：含0.1%甲酸的甲醇；补偿液流速：0.1 mL·min-1。

2.4 质谱条件

正离子检测模式；离子源：ESI源；离子源温度：350 ℃；脱溶剂管温度：200 ℃；加热模块温度：400 ℃；雾化气流量：3 L·min-1；加热气流量：10 L·min-1；干燥气流量：10 L·min-1；其他质谱参数见表1。

表1 质谱参数

2.5 对照品及供试品的制备

（1）对照品混合储备液的制备。分别精密量取“2.1.1”项下格列吡嗪、格列本脲、格列美脲、格列喹酮、盐酸罗格列酮对照品储备液各0.1 mL至同一100 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得浓度均为0.1 μg·mL-1的对照品混合储备液。

（2）供试品超临界提取流程。选取不含上述5种降糖类化学药的中成药，精密称取0.3 g，放入5 mL规格超临界萃取装置的萃取罐中，以超临界状态的二氧化碳为提取溶剂，加入体积分数为8%甲醇（含0.1%甲酸）为夹带剂，按照“2.1”项下的超临界萃取条件进行提取，即得。

2.6 标准曲 线的制备

精密吸取“2.4.1”对照品混合储备液0 μL、15 μL、50 μL、100 μL、200 μL、500 μL、800 μL、1 000 μL，用甲醇稀释至1.0 mL，摇匀，配制成系列标准曲线工作液（0 ng·mL-1、1.5 ng·mL-1、5 ng·mL-1、10 ng·mL-1、20 ng·mL-1、50 ng·mL-1、80 ng·mL-1、100 ng·mL-1） 。以空白滤纸片为基质，分别精密吸取上述系列标准曲线工作液100 μL于基质表面，按照本试验选取的在线超临界流体萃取-超临界流体色谱-串联质谱法检测条件进行测定。以标准品质量（ng）为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线，得各组分的回归方程及相关系数（见表2）。测定结果可见，该方法在试验范围内线性关系良好。

表2 各组分线性关系测定结果

2.7 重复性实验

本研究以超临界专用空白滤纸片为基质，放入5 mL规格超临界萃取装置的萃取罐中，分别精密吸取“2.5”项下的20 ng·mL-1对照品混合溶液100 μL于基质表面，平行测定6次，按照本试验选取的在线超临界流体萃取-超临界流体色谱-串联质谱法检测条件进行含量测定，计算。结果格列吡嗪、格列本脲、格列美脲、格列喹酮、盐酸罗格列酮的质量分别为1.989 ng、1.950 ng、1.956 ng、1.953 ng、1.969 ng，RSD分别为0.13%、0.13%、0.13%、0.14%、0.14%。

2.8 加样回收率实验

本研究分别以不含上述5种降糖类化学药的中成药为空白基质，每份称取0.3 g，放入5 mL规格超临界萃取罐中，共18份，分别精密吸取“2.5”项下的浓度为1.5 ng/mL 、5 ng/mL 、20 ng/mL的对照品溶液100 μL于空白基质表面，混匀，按照本试验选取的在线超临界流体萃取-超临界流体色谱-串联质谱法检测条件测定含量，计算平均加样回收率。结果中成药中格列吡嗪、格列本脲、格列美脲、格列喹酮、盐酸罗格列酮的平均加样回收率范围分别为94.8%～97.5%、94.2%～96.3%、95.0%～96.3%、94.6%～96.4%、94.5%～98.0%，RSD范围分别为 6.4%～7.3%、6.4%～7.1%、6.2%～7.0%、6.7%～7.6%、6.2%～8.4%。回收率测定结果见表3，SFE-SFC-MS/MS Online测定图如图1所示。

图1 5种降糖类化学药的回收率SFE-SFC-MS/MS质谱图

表3 回收率测定结果 n=6

2.9 最低检测浓度

按“2.7”项下方法，用甲醇不断稀释对照品混合溶液，取稀释后的对照品溶液100 μL于不含上述5种降糖类化学药的中成药空白基质表面，混匀，按照本试验选取的在线超临界流体萃取-超临界流体色谱-串联质谱法检测条件测定，记录峰面积，在信噪比S/N约为10时测得最低检测浓度为0.5 ng·g-1。

2.10 实际样品分析

本研究应用该方法对22份正规药店销售的降糖类中成药和保健品样品（包括16份中成药和6份保健品），进行了格列吡嗪、格列本脲、格列美脲、格列喹酮、盐酸罗格列酮5种降糖类化学药的在线分析，均未检出上述降糖物质。结果证明，经过市场监管局加大对市场抽检及风险评估等监管活动的力度，正规药店市售的降糖类中成药和保健品安全性显著提高，广大糖尿病患者的饮食用药安全得到较好的保障。

3 优化及结论

3.1 色谱条件的优化

本研究采用超临界二氧化碳-含0.1%甲酸的甲醇为流动相，优化比较改性剂为甲醇和乙腈，两者的分离效果无明显差异，因而采用甲醇为改性剂。本研究进一步比较甲醇和含0.1%甲酸的甲醇，加入0.1%甲酸后的甲醇能够显著增强化合物的相应，故选择含0.1%甲酸的甲醇作为最终改性剂。

3.2 质谱条件的优化

在超临界二氧化碳-含0.1%甲酸的甲醇的梯度洗脱条件中，5种非法添加化学药采用正离子模式可以获得较好的灵敏度和稳定性，可在相应模式下对质谱条件进行优化，优化加热气流量、干燥气流量、加热模块温度、离子源温度、脱溶剂管温度等参数，选择灵敏度高、重现性好的离子作为定量离子，其余的选作定性离子。

3.3 结论

在降压类中成药及保健品等制剂中非法添加化学药物的行为，已经成为不法分子通过制售假药谋取暴利的重要手段，这一现象也已得到相关部门的高度重视，然而功能性的中成药和保健品种类繁多，化学成分复杂，加上不法商贩的制假行为层出不穷，有些违法生产厂家为躲避监管，常降低单一药物投入量，采取同一种类多种药物或多种类药物混合添加的形式达到宣称的目的[10]。针对这一问题，现在虽然已有一些检测手段，但是普遍存在前处理复杂、检验周期长的问题，不适于批量快筛，补充开发新的快速检测方法和手段已刻不容缓。本研究开发的在线超临界流体萃取-超临界流体色谱-串联质谱法，与现行检验方法相比，样品只需经过简单处理即可上机检测，简化了提取过程，实验过程快速、环保、灵敏度较高，可快速筛查降糖类中药及保健品中非法添加5种化学药。