犊牛腹泻病原学检测及体外药物敏感性试验

赵红霞，吕向聪，宋 晨，郭文瑞，郭 宇，王建龙，周伟光,樊宏亮

(1.内蒙古农业大学兽医学院，内蒙古 呼和浩特 010010；2.内蒙古动物疫病预防控制中心，内蒙古 呼和浩特 010010；3.内蒙古伊利实业集团股份有限公司，内蒙古 呼和浩特 010010)

我国犊牛腹泻发病率远远高于发达国家[1]，尤其在我国气候寒冷、干燥的北方地区。目前临床中大肠杆菌感染的疾病主要通过抗菌药物进行治疗[2]，但长期使用易产生耐药性，使其治疗效果下降或无效。为了提高犊牛腹泻的治愈率，本试验对内蒙古呼和浩特周边地区犊牛场腹泻犊牛的腹泻病料进行病原学检测，并对其中的主要病原菌进行体外药物敏感性测定，旨在筛选出对其敏感的抗菌药物，从而为有效防治犊牛腹泻提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 样本来源 2018年10月—2019年6月,在内蒙古呼和浩特周边地区4个犊牛养殖场选取精神萎靡、食欲不振或体温升高，排淡黄粥样或白色水样粪便，或粪便带有泡沫、腥臭味、腐臭味的腹泻犊牛，共采样50份。

1.2 主要试剂 普通琼脂培养基、营养肉汤培养基、麦康凯琼脂培养基(MK)、伊红美蓝琼脂培养基(EMB)，均购自青岛高科园海博生物技术有限公司；肠杆菌生化鉴定管以及四环素(30 μg/片)、多西环素(30 μg/片)、氧氟沙星(5 μg/片)、恩诺沙星(5 μg/片)、氨苄西林(10 μg/片)、头孢喹肟(30 μg/片)、庆大霉素(10 μg/片)、链霉素(10 μg/片)、多黏菌素B(30 μg/片)、氟苯尼考(30 μg/片)共10种药敏片，均购自杭州天和微生物试剂有限公司；病毒基因DNA/RNA提取试剂盒，购自天根生化科技(北京)有限公司；细菌基因组DNA提取试剂盒，购自洪阳生物技术有限公司。

1.3 主要试验仪器 智能生化培养箱，购自宁波江南仪器厂；电子天平，购自德国赛多科斯股份公司；超净工作台，购自上海跃进医疗器械厂；电泳仪，购自北京市六一仪器厂。

1.4 病毒的检测 对常引起犊牛腹泻的4种病毒[牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛轮状病毒(BRV)、牛冠状病毒(BCoV)和牛细小病毒(BPV)]进行检测,所用引物根据参考文献[3-4]进行设计,由北京六合华大基因科技有限公司合成，引物序列见表1。病毒采用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)和PCR进行检测。取被检粪样1 g，加生理盐水4 mL混匀;反复冻融2次，8 000 r/min离心10 min，取上清，用病毒 DNA/RNA 提取试剂盒提取病毒核酸样品，具体操作步骤按试剂盒说明书进行。PCR反应体系(20 μL)：模板3 μL，上、下游引物各 1 μL，PremixTaq10 μL,ddH2O 5 μL。PCR反应条件:94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min,共30个循环；72 ℃延伸10 min。PCR反应产物用15 g/L琼脂糖平板凝胶电泳进行检测。

表1 病毒检测引物序列

1.5 细菌的分离培养与纯化 在超净工作台下，将病料置于灭菌生理盐水中混匀，接种于已配制好的无菌营养肉汤中，37 ℃培养24～36 h进行增菌。待菌液呈浑浊时，接种到伊红美蓝培养基中，37 ℃培养18 h，挑取有紫黑色并带有绿色金属光泽的单菌落接种于麦康凯培养基上，37 ℃培养18～24 h，得到单一的鲜红菌落，进行革兰染色镜检和生化鉴定。

1.6 分离菌的生化鉴定 用接种针挑取已分离纯化的单一菌落，进行三糖铁、五糖发酵、IMViC试验[包括靛基质(I)试验、甲基红(M)试验、二乙酰(V)试验、柠檬酸盐(C)试验]、尿素酶试验进行生化鉴定；能分解葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇产酸产气，不分解蔗糖，三糖铁斜面和底部均为黄色，且有气体产生，不产H2S，IMViC试验结果为“++--”的细菌判定为大肠杆菌。

1.7 分离菌的PCR鉴定 将生化鉴定疑似大肠杆菌的菌样，以按照TaKaRa细菌基因组DNA提取试剂盒说明书提取的DNA为模板，使用16S rDNA通用引物进行PCR扩增。PCR引物序列[2]见表2。PCR反应体系(25 μL):模板1.0 μL，引物27F、1492R各0.5 μL,PremixTaq12.5 μL,ddH2O 10.5 μL。PCR反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共25个循环;72 ℃延伸10 min。PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测，PCR阳性产物送至北京六合华大基因科技有限公司测序并将结果上传到NCBI中进行序列比对，确定菌种。

表2 大肠杆菌检测引物序列

1.8 药敏试验 采用K-B法进行药敏试验，选择临床常用的10种药敏纸片，参考美国临床实验室标准化委员会(NCCLS)(2009年)进行药敏结果的判读，抑菌圈直径<10 mm判定为耐药；抑菌圈直径>15 mm判定为敏感；10 mm≤抑菌圈直径≤15 mm判定为中介。

2 结果

2.1 病毒的检测 病毒病原检测结果如表3所示，50份粪样中BVDV、BRV以及BVDV和BRV混合感染检出率分别是34%(17/50)、44%(22/50)、16%(8/50)，而BCoV、BPV均为阴性。

表3 犊牛腹泻粪样中病原检测结果

2.2 分离菌培养特性 分离菌株在普通琼脂培养基上生长良好，直径2～3 mm，边缘整齐、灰白色，呈半透明的菌落。在麦康凯琼脂培养基上呈粉红色、圆形、隆起、表面光滑、边缘整齐的菌落。在伊红美蓝琼脂培养基上形成紫黑色菌落(图1)，并带有绿色金属光泽。革兰染色镜检(图2)为阴性、两端钝圆的小杆菌。

图1 分离菌在伊红美兰平板上的菌落形态

图2 分离菌革兰染色镜检形态(100×)

2.3 分离菌生化特性 将分离到的39株疑似大肠杆菌菌株进行生化鉴定，结果见表4。根据乳糖发酵试验和IMViC试验结果可以得出，分离到的39株疑似大肠杆菌均符合大肠杆菌的生化特性。

表4 疑似大肠杆菌的生化鉴定

2.4 分离菌PCR鉴定 将39株分离菌16S rDNA基因PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳，结果如图3所示，扩增条带大小与标准菌株ATCC 25922条带大小相符(1 500 bp 左右)。

图3 大肠杆菌16S rDNA的PCR扩增

2.5 药敏试验 39株大肠杆菌体外药物敏感性试验结果如表5和图4所示，大肠杆菌具有多重耐药性，并且对四环素、多西环素、庆大霉素、链霉素的耐药率最高，均高于90.0%。其次是氟苯尼考(84.6%)、氧氟沙星(79.5%)、氨苄西林(76.9%)、恩诺沙星(74.4%)，但对头孢喹肟和多黏菌素B具有较强的敏感性，敏感率达60.0%以上。

图4 犊牛腹泻大肠杆菌多重耐药水平

表5 39株分离菌的药敏试验

3 讨论

本试验通过对内蒙古呼和浩特周边地区部分规模牛场进行调研，发现犊牛腹泻普遍存在，且严重危害饲养场的经济发展。本试验对50份犊牛腹泻粪便样品进行BVDV、BRV检测，结果显示，BVDV 检出率(34%)略高于2015年Deng等[5]报道的全国奶牛阳性率(32.06%)和2019年孙力等[6]报道的新疆地区阳性率(24.6%)，但低于2019年宋维彪等[7]报道的青海省牦牛阳性率(51.59%)。我国不同地区BRV的感染率和流行率差异较大，平均流行率介于30%～40%，而欧美等国感染率高达90%以上[8]。本试验BRV的检出率为44%，BVDV和BRV混合感染率为16%，说明内蒙古呼和浩特周边地区存在着严重的病毒性感染，建议加强疫病的防控，同时在保障安全有效的前提下对持续感染(Persistent infection，PI)牛开展净化淘汰。

有研究报道[9-10]显示，大肠杆菌感染也是引起犊牛腹泻的主要原因之一，临床上根据大肠杆菌引起的犊牛腹泻的病理特征和病变情况将其分为败血型、肠毒血型以及肠炎型，病情严重时患牛几天内就可能死亡。本试验对50份样品进行细菌分离鉴定，通过生化鉴定和PCR鉴定共分离出39株大肠杆菌，分离率为78%，与杨斯琴等[11]报道的内蒙古呼和浩特地区牛源致病性大肠杆菌的检出率(79%)基本一致。斯木古德等[12]报道的荷斯坦牛新鲜粪便大肠杆菌检出率为40.12%，与本试验大肠杆菌检出率相比较低。本试验结果和其他学者报道的研究结果均表明，大肠杆菌的流行存在着明显的地域差异性。应通过加强饲养管理、科学规范消毒环境和用具，预防犊牛场大肠杆菌病的暴发。

本试验选取临床常用的10种抗菌药进行体外药物敏感性试验，结果显示，39株大肠杆菌对10种抗菌药的耐药程度不容乐观。39株分离菌对四环素、多西环素、庆大霉素、链霉素、氟苯尼考、氨苄西林、恩诺沙星和氧氟沙星7种抗菌药物均产生耐药性，并且耐药率均高于70%，不推荐临床中继续使用这些抗菌药。2015年，崔冰冰[13]对中国北方部分规模化奶牛场的34株犊牛腹泻大肠杆菌对22种常用抗生素的耐药情况进行了分析，发现对10种以上抗菌药耐药的菌株有24株，占比达70.59%。2016年，刘少昆[14]从北京、天津牛场腹泻犊牛样本中共分离到32株强致病性大肠杆菌，并对其多重耐药性进行分析，发现天津地区犊牛大肠杆菌致病株全部为多重耐药菌株，最多对16种抗菌药耐药，其中对14种抗菌药耐药的菌株占比最大；北京地区中仅1株只耐1种药物，对13种抗菌药耐药菌株占比最大。本试验分离菌株对多黏菌素B和头孢喹肟的敏感性达60%以上，可在临床中继续使用，但应规范使用。上述数据表明，犊牛腹泻大肠杆菌多重耐药普遍存在，细菌多重耐药性的产生不仅给动物疾病的防治带来了困难，同时还给食品安全以及人类健康造成严重的威胁。因此，应寻找新型安全天然添加剂作为抗菌药物的替代品，如黄芪多糖、天蚕素等中草药，既可以增强动物机体的免疫力，又有抗菌功效，且不存在药物残留问题[15-17]，同时要加强平时的饲养管理，提高机体免疫力，减少疾病的发生。