苹果及其制品中展青霉素研究进展

王利平，王丽霞，刘保友，张悦丽，张伟

(1.烟台市福山区农业技术推广中心，山东烟台 264000；2.山东省烟台市农业科学研究院，山东烟台 265500；3.烟台市科技馆，山东烟台 264001；4.烟台大学生命科学学院，山东烟台 264005；5.山东省农业科学院植物保护研究所，山东济南 250100)

中国苹果及其制品在世界苹果产业中占有极其重要的地位。在采后流通储存阶段，苹果在合适的温湿度条件下易受到病原菌，尤其是可产生高毒性毒素的真菌侵染，不仅对苹果产业造成巨大损失，而且严重威胁消费者的身体健康[1]。其中，青霉属真菌(Penicilliumspp.)是主要的病原菌之一，对苹果及其制品的侵染严重[2,3]。该属真菌会产生一种称为展青霉素(Patulin，PAT)的真菌毒素，具有“三致”效应的负面影响[2,4]，被国际癌症研究机构(IARC)归为第三类可疑致癌物质[5]。展青霉素对中国苹果及其制品的质量安全已造成严重影响。笔者就展青霉素产生菌、理化性质及毒性、污染现状、降解及检测方法等作了介绍，旨在对苹果及其制品中展青霉素的研究及防控提供参考。

1 展青霉素产生菌

展青霉素又称棒曲霉素，1941年由Glister首先发现并分离纯化，命名为Patulin(Pat)。主要由青霉属(Penicillium)的扩展青霉(P.expansum)、产黄青霉(P.chrysogenum)、展青霉(P.patulum)、园弧青霉(P.cyclopium)、常现青霉(P.frequentan)、壳青霉(P.crustosum)、娄地青霉(P.roqueforti)、棒形青霉(P.claviforme)、新西兰青霉(P.novae-zeelandiae)、灰黄青霉(P.griseofulvum)、石状青霉(P.lapidosum)、粒状青霉(P.granulatum)、梅林青霉(P.melinii)、产黄青霉(P.chrysogenum)等，以及曲霉属(Aspergillus)的棒曲霉(A.clavalus)、土曲霉(A.terreus)、巨曲霉(A.giganteus)，丝衣霉属(Byssochlamys)的雪白丝衣霉(B.nivea)等菌株产生[6-10]。目前苹果及其制品中最常见的展青霉素产生菌为扩展青霉。

2 展青霉素的基本性质与危害

展青霉素的分子式为C7H6O4，属杂环内酯类物质，其固体为无色状，易溶于氯仿、乙醇、丙酮、水等溶剂，在酸性环境中非常稳定，在碱性条件下活性降低[11-14]。

20世纪40年代研究表明，展青霉素可抑制细菌生长并对治疗感冒有效果[3]。但随后研究明确其对动物和高等植物具有毒害作用，于20世纪60年代将其划分为毒素[15]。世界卫生组织(WHO)认为展青霉素具有较强的基因毒性，国际癌症研究机构(IARC)将其归为第3类致癌物。1984年，北京西郊某牧场奶牛反应过敏和肌肉震颤，就是因为食用了以棒曲霉为优势菌的霉变芽根[16]。展青霉素具有较强的急性毒性，啮齿动物的半致死剂量(LD50)为20～100 mg/kg，家鸡为50～170 mg/kg[2]。Smith等发现将老鼠胚胎置于浓度为47～55 μmol/L的展青霉素环境下，核酸、蛋白质、体细胞数等显著降低；当展青霉素浓度增加至62 μmol/L时，胚胎40 h内死亡[17]。展青霉素可影响鸡胚的正常发育，孵化出的小鸡具有眼突、爪外张等不良症状[1]。有报道称，给2个月的雄性大鼠皮下注射展青霉素，每周2次，每次0.2 mg，从58周起在注射部位产生局部肉瘤[18]。展青霉素还可能通过线粒体途径引起人胚肾细胞293凋亡[19]。

3 展青霉素在苹果及其制品中的污染现状

展青霉素存在于霉烂苹果及其制品中，与链格孢毒素、赭曲霉毒素、黄曲霉毒素被认定为世界果品中最为重要的毒素类别。病菌经气孔或表面伤口侵入苹果表皮并在适合条件下繁殖，进一步侵染到周围的健康果肉组织[20]。若采用被病菌侵染的果实作为加工原料，展青霉素就被带入产品，造成毒素污染并长期稳定存在[21,22]。新鲜水果中很少有展青霉素产生，但新鲜水果中多能分离得到青霉菌或曲霉等展青霉素产生菌[8]。有些苹果制品是仅靠肉眼剔除了腐烂部分保留无病斑部分加工制成的，而此时展青霉素产生菌的菌丝可能已经侵染但还未使苹果表现病变症状，毒素已经存在。苹果果实腐烂病斑处，展青霉素最大含量可达1 000 μg/kg；苹果汁中含量达0.5～1 150 μg/kg；整果平均含量可达21～746 μg/kg；采用腐烂苹果作为原料制成的产品中可达0.79～140 μg/kg[23,24]。李秀芳等对中国4个地区的62份霉烂苹果和梨进行了霉菌分离鉴定和展青霉素的测定结果表明，各地区苹果中展青霉素的主要产毒菌是扩展青霉[25]。

4 展青霉素及其产生菌的降解和防控

对展青霉素的防控研究主要集中在两个方面：在果品生产、贮运过程控制展青霉素产生菌的生长繁殖及产毒；在加工过程中对已产生的毒素进行降解与消除。

展青霉素的降解消除通常采用的物理方法包括吸附法、微波法、超声波法、紫外辐照法等，可将真菌毒素污染水平降低，但不能完全脱除。如硅胶能够较好地脱除苹果汁中的展青霉素；超声波功率490 W时，展青霉素的降解率最高，超声波波频率45 kHz时对展青霉素的降解效果最佳[26]。Liu等制备了掺有GO-SH的气凝胶，可使苹果汁中的PAT降低(89±1.23)%，且不会引起果汁品质恶化和细胞毒性[27]。通过添加诱抗剂、杀菌剂等化学试剂可控制病菌生长或消减毒素量[28]。葛永红等用1%柠檬酸诱抗剂能显著降低损伤接种苹果果实P.expansum病斑直径，提高果实过氧化物酶等酶的活性和品质[29]。丁香精油、大蒜精油、百里香精油、薰衣草精油也可抑制扩展青霉的孢子萌发[30,31]；茶多酚及香草酸能有效抑制扩展青霉[32]；另外臭氧处理是高效、安全、低廉的展青霉素降解方法，且杀菌性强，不产生二次污染。杀菌剂等物质严格按说明使用，注意安全间隔期，可保障果品安全生产及人身健康[33]。从安全方面来看，真菌菌素的毒性比绝大多数杀菌剂等物质的毒性高得多。因而，当前及今后较长时期，化学防治仍是病害防控及其毒素控制的主要方法。目前生物学方法主要包括微生物降解和拮抗作用，其中酵母是目前研究最多的微生物资源，1977年就报道通过酵母发酵可降解90%的展青霉素[34]。国内外很多研究发现酵母菌和乳酸菌对展青霉素具有良好的降解、去除作用[4,35-38]。孙艺文等发现，拟粉红锁掷孢酵母(Sporidioboluspararoseus)代谢产生的胞内酶可以降解展青霉素，显著降低苹果伤口处展青霉素的积累量[39]。付瑞敏等[40]研究表明，生防菌海洋解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)BA-16-8抑制扩展青霉的关键物质是脂肽类抗生素 Fengycin，通过抑制6-MSAS基因表达而抑制展青霉素的合成，经处理后，单位质量的扩展青霉菌丝体中展青霉素的积累量显著下降。鉴于生物防治对环境低污染甚至无污染、对人畜风险低等优点，未来作为控制真菌毒素的主要技术潜力巨大。

5 展青霉素的检测方法

薄层色谱法最早用于检测水果中展青霉素的含量[41]，但由于薄层色谱法操作繁琐、检测精确度低、可重复性和再现性差，目前已不再使用。2017年6月23日实施的GB 5009.185 -2016 《食品安全国家标准 食品中展青霉素的测定》删除了薄层色谱法，增加了同位素稀释-液相色谱串联质谱法和高效液相色谱法。Tarter等首次采用七氟丁酰衍生化毛细管气相色谱-电子捕获法测定苹果汁中展青霉素的含量，采用乙酸乙酯萃取，电子捕获检测器在0.05～0.50 ng的范围内成线性，总方法平均回收率为84%，气相色谱检测限≤10 pg/L，且方法灵敏、重复性高[42]。毛艳玲等采用气相色谱-质谱法对苹果样品中展青霉素进行分析测定，表明该方法操作步骤简单、试剂用量少，处理时间短[43]。

最常用的定量分析毒素的方法是高效液相色谱法，通过反相C18柱将毒素与干扰物羟甲基糠醛分离，再经荧光、紫外或质谱检测，具有很高的稳定性、选择性和灵敏度。展青霉素是极性小分子量物质，其紫外吸收光谱强，适合用高效液相色谱法进行检测。殷居易、张苗等采用高效液相色谱法测定了浓缩苹果汁中展青霉素的含量，表明该方法操作简单、快速、准确灵敏[44,45]。孟瑾等采用高效液相色谱法测定结果表明，山楂汁和苹果汁中展青霉素检出限分别为8 μg/L和7 μg/L[46]。

随之，更多研究者改进了高效液相色谱测定展青霉素的方法。Vural等采用乙酸乙酯提取样品、碳酸钠溶液萃取，建立了快速、简便、经济的反向液相色谱法测定苹果汁中展青霉素的方法，其回收率高于98%，检出限小于5 μg/L[47]。Jalali等利用紫外检测器对伊朗150份商用苹果汁中的展青霉素进行高效液相色谱分析，采用C18-SPE柱净化样品，平均浓度为26～92 μg/L，灵敏度和回收率均可满足检测分析的需求[48]。Sewram等通过大气压化学电离模式液质联用方法测定了苹果汁中的展青霉素，该方法具有灵敏度高、回收率高、检测限低至10 mg/L的特点，且对加标苹果果汁样品的检测限为4 mg/L[49]。

最近，更多的色谱串联技术被用于检测展青霉素。Li等建立了山楂和苹果饮料中展青霉素的固相过滤柱和液相色谱法(UPLC-MS/MS)检测方法，在保证准确度和精密度的前提下，4 min内即可完成样品中展青霉素的检测[50]。项瑜芝等建立了同位素稀释高效液相色谱法对苹果汁、苹果醋和苹果酱等30份样品中的展青霉素进行测定，展青霉素在5～250 mg/L浓度范围内线性关系良好，回收率90%以上，可以满足GB 2761 - 20112017《食品安全国家标准 食品中真菌毒素限量》对于水果制品、果蔬汁和酒类(仅限苹果和山楂)中展青霉素残留的检测要求[51]。Li等采用同位素稀释液相色谱-串联质谱法(ID-LC-MS/MS)测定苹果汁中的展青霉素，检测限低至0.2 μg/kg，在1～400 μg/kg范围内建立了基质匹配线性(r2= 0.9997)，回收率97.2%以上[52]。马雪涛等采用分子印迹亲和固相萃取技术进行样品前处理、液相色谱-串联质谱检测果蔬制品中展青霉素，能够很好地排除复杂样品中的假阳性现象，提高了检测准确性[53]。David等应用在线分子印迹聚合物固相萃取微芯片在毛细管电泳和质谱联用测定展青霉素，检测限为1 μg/kg，线性范围为1～100 μg/kg[54]。Shukla等成功地合成了一种不需要生物或化学受体或特异性抗体的还原性氧化石墨烯/氧化锡(rGO/SnO2)复合材料，电化学传感器能够快速检测苹果汁样品中的展青霉素，而无需提取或净化步骤，在短时间内的回收率(74.33±0.70～99.26±0.70)%高于高效液相色谱法(61.97±1.78～84.31±1.96)%[55]。

6 结论及展望

展青霉素具有急性毒性、基因毒性、致畸性和致癌性，目前世界各国已意识到展青霉素对人类健康存在潜在威胁，并制定了相关限量标准来限定水果及其相关制品中的展青霉素含量。欧盟(EU)规定展青霉素的最大限量在果汁产品或饮品中为50 μg/kg、在苹果肉产品中为25 μg/kg、标签为婴儿产品的为10 μg/kg。世界卫生组织(WHO)规定苹果汁中展青霉素的最高限量标准为50 μg/kg。中国现行食品安全国家标准GB 2761 - 2017规定苹果、山楂果汁展青霉素限量为50 μg/kg[56]。今后还需要对检测技术深入研究，进一步降低毒素的检出限，提高检测精密度，建立展青霉素在苹果及制品中的检测方法，同时深入开展毒素毒理学研究，为更科学地制定展青霉素限量标准提供依据。