千金子二萜醇调控TGF-β1/Smad通路影响肾癌小鼠TNF-α和IL-17表达①

蒋俊玲 赵俊峰 张嘉琪 周 磊 潘世杰 雷 震（河南中医药大学第二临床医学院，郑州 450002）

肾癌是一种源于肾小管上皮的恶性肿瘤，2020年数据显示，全球肾癌的新发病例占所有癌症的4.1%，约2.4%患者死于肾癌［1］。肾癌治疗以外科手术为主，综合性治疗为辅，一旦术后复发转移，免疫治疗的治愈率仅为20%左右［2-4］。因此，寻找延长肾癌患者有效生存率的新药迫在眉睫。中药千金子（Euphorbiae semen）记载于多种医书，是续随子（Euphorbia lathyrismL，属大戟科植物）成熟后干燥的种子，别名小巴豆和蒲萨豆，具有多种抗肿瘤和抗肿瘤多重耐药的活性成分。大戟提取物可抑制多种肿瘤（肺癌和肝癌）细胞体外增殖和转移。本课题组前期研究发现，千金子二萜醇可抑制肾癌Renca细胞增殖（调控Bax、Bcl-2、Caspase-3及G0/G1期进程）、转移和侵袭，体内实验证实其可减缓肿瘤进展、调控NF-κB活性抑制MMPs表达。

作为一种较为普遍的促炎细胞因子，近年多数肿瘤和炎症中可检测到TGF-β1含量升高，可促进癌细胞增殖和转移［5］。TGF-β1/Smad可调控晚期癌症进展［6］。研究表明，TGF-β1可调控Smad2/3蛋白影响Foxp3（叉头状转录因子）和RORγt（维甲酸受体相关孤儿受体）表达，从而调控Th17细胞影响其下游细胞因子TNF-α和IL-17表达［7］。高表达的IL-17和TNF-α等细胞因子可促进肿瘤进展和分期［8-9］；TNF-α可增加DNA损伤和突变、异常细胞增殖和新生血管形成、MMPs产生、血管通透性和渗漏性促进癌症进展；IL-17可促进MMPs释放，通过诱导胶原和蛋白多糖蛋白水解变性，促进免疫细胞向炎症部位迁移，诱导VEGF释放，促进癌细胞迁移和组织入侵。研究发现，TGF-β1、IL-17和TNF-α等因子表达降低可抑制肾癌侵袭和转移［10-12］。目前，国内外关于千金子能否调控TGF-β1/Smad通路活性从而影响肾癌中TNF-α和IL-17表达尚未见报道。

因此，本研究通过构建Renca肾癌小鼠模型，探讨大戟提取物能否通过调节TGF-β1/Smad通路活化影响TNF-α和IL-17表达，进一步阐释千金子的抗癌机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂 千金子二萜醇（四川维克奇生物科技有限公司）；RPMI1640、FBS、0.25%胰酶-EDTA和Phosphate Buffered Saline（以色列BI公司）；青-链霉素混合液、二甲基亚砜、普通组织RIPA裂解液和ECL显影液（索莱宝公司）；PEG-300和SB-431542（Med Chem Express公司）；BCA蛋白定量试剂盒（碧云天生物技术有限公司）；p-Smad2/p-Smad 3 Rabbit mAb（CST公 司）；Smad2/3 Rabbit pAb（ABclonal公司）；内参蛋白GAPDH Rabbit Polyclonal antibody（武汉三鹰有限公司）；TNF-α和IL-17A ELISA试剂盒（联科生物）。

1.1.2 细胞及实验动物Renca细胞（北纳创联生物技术有限公司）；4～8周龄雄性SPF级BALB/c小鼠（北京斯贝福生物技术有限公司），许可证号：SCXK（京）2019-0010，体质量18～22 g，于25℃、12 h光照/12 h黑暗实验动物中心常规饲养，正常饮食饮水。动物实验经河南省中医院（河南中医药大学第二附属医院）伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 Renca细胞培养 将完全培养基中的Renca细胞恒温培养至85%饱和，胰蛋白酶消化，离心，制备1×107个/ml细胞悬液，Countstar计数。

1.2.2 小鼠肾癌模型构建及分组给药 小鼠腋窝（右前肢）皮下注射细胞悬液（0.2 ml/只），随机分为模型组、实验组和SB-431542组，10只/组，密切观察肿瘤生长情况，长至5 mm约14 d，各组间瘤块生长无明显差异时开始给予药物干预。实验组（千金子二萜醇组）灌胃给予20 mg/kg千金子二萜醇溶液；模型组灌胃给予等量生理盐水；SB-431542组（TGF-β1/Smad通路抑制剂组）给药17 d开始连续腹腔注射10 mg/kg SB-431542溶液3 d，共给药19 d，每3 d测量小鼠体质量及瘤块长、短径。给药结束后，腹腔注射1%戊巴比妥钠（50 mg/kg）麻醉小鼠，眼科弯头镊摘除小鼠眼球后取血，置于2 ml EP管离心，取上清，低温保存，小心剥离小鼠皮下移植瘤瘤块于液氮中冷冻，分离各组小鼠完整脾脏并称重。

1.2.3 脾脏指数计算 计算各组肾癌移植瘤小鼠脾脏指数，脾脏指数（%）=脾脏重量（mg）/小鼠体质量（g）×100%，并进行分析。

1.2.4 Western blot检测瘤块TGF-β1/Smad通路表达 取米粒大小的瘤块放入蛋白裂解液中提取蛋白，BCA法定量蛋白，SDS-PAGE凝胶电泳，转至NC膜，5%脱脂奶粉封闭，加入Smad2/3和p-Smad2/3及GAPDH一抗4℃摇床孵育过夜，清洗后加入山羊抗兔抗体孵育1 h，ECL显色，定量分析条带灰度值。

1.2.5 ELISA检测TNF-α和IL-17水平 将ELISA试剂盒及实验物品平衡至室温，按说明书操作，提前配备所需试剂，样本孔里预先加入检测缓冲液（×10倍稀释为×1倍）80µl，加入20µl血清（室温）振荡混匀，测定小鼠血清450 nm、570 nm处OD值，按照实验最终得到的标准曲线及OD值进行计算。

1.3 统计学分析 采用SPSS21.0软件分析数据，计量数据以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 千金子二萜醇对肾癌移植瘤小鼠脾脏指数的影响 如图1所示，给药19 d后，实验组和SB-431542组小鼠脾脏指数明显低于模型组（4.71±1.11，4.45±0.34vs6.29±2.40），差异有统计学意义（F=3.626，P＜0.05）。

图1 各组肾癌移植瘤小鼠脾脏指数Fig.1 SI of RCC transplanted mice in each group

2.2 千金子二萜醇对肾癌Renca移植瘤小鼠TGF-β1/Smad信号通路蛋白表达的影响 给药19 d后，实验组与SB-431542组小鼠Smad2/3蛋白表达明显高于模型组（2.57±0.24，2.73±0.57vs1.56±0.29，F=7.858，P＜0.05），实 验 组 与SB-431542组 小 鼠p-Smad2/3蛋白表达明显低于模型组（0.32±0.08，0.22±0.09vs0.71±0.04，F=37.61，P＜0.01，图2）。

图2 Western blot检测小鼠瘤块中TGF-β1/Smad通路激活情况Fig.2 Activation of TGF-β1/Smad pathway in mouse tumor mass detected by Western blot

2.3 千金子二萜醇对肾癌小鼠血清TNF-α和IL-17表达的影响 给药19 d后，与模型组相比，实验组和SB-431542组小鼠血清TNF-α和IL-17含量降低（P＜0.01），但后两组间差异无统计学意义（P＞0.05，表1）。

表1 各组肾癌移植瘤小鼠血清TNF-α和IL-17表达（±s，n=8，pg/ml）Tab.1 Expressions of TNF-αand IL-17 in serum of RCC transplanted mice in each group（±s，n=8，pg/ml）

表1 各组肾癌移植瘤小鼠血清TNF-α和IL-17表达（±s，n=8，pg/ml）Tab.1 Expressions of TNF-αand IL-17 in serum of RCC transplanted mice in each group（±s，n=8，pg/ml）

Note：1）P＜0.01 vs model group.

Groups Model Experimental SB-431542 F P TNF-α 31.23±1.56 22.95±0.601）21.82±1.35 137.15＜0.01 IL-17 8.52±1.16 5.87±0.721）5.19±0.67 32.20＜0.01

3 讨论

千金子作为我国传统大戟属中草药，性温味辛，毒性较小，调理大肠、肝和肾，主祛水消肿和破血消癥，在痰饮、积滞胀满、水肿和大小便不畅等疾病治疗中发挥作用。多位学者研究其化学成分及药理作用发现，千金子中的二萜类、甾醇及香豆素等成分具有一定抗肿瘤、致泻、抗炎镇痛和美白等作用，其中二萜类化合物起主要作用。陶丽等［13］发现，千金子二萜醇及其衍生物对NSCLC有一定抗癌疗效，在其母体醇环中引入酯类可增强抗肿瘤活性。ZHANG等［14］研究发现，千金子二萜类化合物能够逆转MCF-7细胞系中ABCB1（一种编码p-糖蛋白的基因）介导的多重耐药。近年本课题组通过研究千金子二萜醇对Renca细胞的作用机制发现，千金子二萜醇能够抑制Renca细胞增殖过程中从G0期过渡到G1期、增加Bax和Caspase-3两个促凋亡蛋白表达从而加速肿瘤细胞凋亡，同时降低Bcl-2表达加速细胞凋亡，并在一定程度抑制其侵袭和转移，深入研究发现，肾癌小鼠模型中NF-κB激活也可被抑制［15］。本研究进一步验证了千金子二萜醇对肾癌小鼠TGF-β1/Smad通路的影响及抗肿瘤机制。

近年肾癌被认为是一种免疫原性肿瘤，从最初IL-6和IL-8等细胞因子的非特异性免疫治疗到针对VEGF的靶向治疗，又转向新的免疫治疗［3，16-19］。研究表明，调节性T细胞等免疫抑制细胞产生的细胞因子能够调控肿瘤微环境（tumor microenvironment，TME），可一定程度介导免疫功能无法精准调节的紊乱。TME由肿瘤血管系统、淋巴细胞及炎症微环境等组成，肿瘤进展与其中的IL-17和TNF-α等因子相关。研究发现，NF-κB通路可被TNF-α和IL-17等因子影响进而调控肿瘤中PD-L1及MMP-2/9蛋白表达，并影响肿瘤侵袭和转移［15，20］。TNF-α是一种可促炎的多能细胞因子。IL-17A（多数指IL-17）是Th17细胞的标志性细胞因子，与IL-17F以同型二聚体或异型二聚体形式分泌，IL-17可与其二聚体受体（异源性）IL-17RA和IL-17RC结合，进一步激活Act1，而后TRAF6蛋白发生激活从而调控MAPK和NF-κB等通路加速肿瘤进展。TGF-β1可促进Th17细胞增殖分化，加强TNF-α和IL-17表达，且这两种细胞因子在肾癌中呈高表达，与肾癌进展和分级有关。TGF-β1与其Ⅲ型受体（TβRⅢ）和TβRⅡ结合，进而募集TβRⅠ二聚体形成四聚体复合物（异源性），受体构象发生改变，导致TβRⅡ发生自身磷酸化，激活TβRⅠ，活化的TβRⅠ可促使Smad2/3蛋白向其磷酸化形式转变，即p-Smad2/3，经过其他因子的辅助作用，Smad4与p-Smad2/3结合形成异源性复合物，在一系列因子作用下到达细胞核，上调Foxp3和RORγt表达而增强Th17细胞增殖分化，分泌IL-17和TNF-α［21-24］。

综上，本研究发现肾癌小鼠TGF-β1/Smad通路激活受千金子二萜醇调控，进而降低血清TNF-α和IL-17含量，脾脏指数亦有所降低。由于缺乏具体基因层面分析及受免疫细胞检测手段所限，本研究仅初步探讨了千金子二萜醇对肾癌的抑制机制，仍需进一步完善相关作用机制和具体靶点，为中医药治疗肾癌提供新的思路。