调节性B细胞在妊娠合并系统性红斑狼疮中的研究进展①

林思涵 王 酉 狄 文 （上海交通大学医学院附属仁济医院妇产科，上海市妇科肿瘤重点实验室，癌基因及相关基因国家重点实验室，上海 200127）

系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）是一种累及多器官脏器的慢性自身免疫性疾病，其以免疫系统失调，大量自身抗体产生以及免疫复合物在多器官、组织中沉积为特征，好发于育龄期女性［1］。由于SLE女性患者常发生妊娠相关并发症及不良妊娠结局如流产、死胎、早产、子痫前期、胎儿宫内生长受限（intra-uterine growth restriction，IUGR）等［2-3］，因此SLE一度被视为妊娠的禁忌。B细胞在SLE发病机制中具有重要作用，其免疫功能出现紊乱是导致SLE发生、发展的关键环节。近年来，调节性B淋巴细胞（regulatory B cells，Bregs）的免疫调节功能逐渐为人们所认识，其通过分泌IL-10、IL-35和转化生长因子（transforming growth factor，TGF）-β等细胞因子发挥免疫调节作用。在SLE和类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）等多种自身免疫性疾病中，Bregs存在数量及功能改变。在正常妊娠过程中，各种免疫细胞和细胞因子共同维持母体对胎儿的免疫耐受是良好妊娠结局的关键，一旦免疫环境调控失衡，不良妊娠结局随之产生。本文就Bregs与妊娠合并SLE的关系进行综述，以期为将来进一步探索Bregs在SLE免疫环境中以及妊娠免疫耐受中所起到的作用提供新方向，并为治疗SLE以及预防和治疗妊娠期狼疮带来新思路。

1 Bregs的表型与功能

传统上认为，B细胞主要通过产生抗体、抗原递呈、以及多种细胞因子发挥正向免疫调节作用。在2000年，MIZOGUCHI等［4］首次正式描述了一种B细胞亚群，这群细胞在炎症性肠病模型小鼠中具有抑制炎症的作用，即Bregs。此外，Bregs在实验性自身免疫性脑脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE）、胶原诱导性关节炎（collagen-induced arthritis，CIA）及结肠炎等实验模型中也产生明显抑制炎症反应［5-7］。CORREALE等［8］观察到多发性硬化症（multiple sclerosis，MS）患者感染蠕虫后产生IL-10分泌功能上调的B细胞亚群，首次证实Bregs在人体中的存在。目前对Bregs尚无统一的分类标准，多数研究根据Bregs分泌的细胞因子和表面标志对其进行分类。产生IL-10是识别Bregs的主要标志，人体内产生IL-10的调节性B细胞主要为过渡性（未成熟）调节性B细胞（CD19+CD24highCD38high）和记忆性调节性B细胞（CD19+CD24highCD27+）。除了产生IL-10介导抑炎效应之外，Bregs还可分泌TGF-β和吲哚胺2，3-二氧化酶（indoleamine 2，3-dioxygenase，IDO），参与调节T细胞活化［9］；CD38+CD1 d+IgM+CD147+Bregs可分泌颗粒酶B（Granzyme B）诱导T细胞凋亡［10］；CD5+CD1dhiFcgRIIbhiBregs通过产生IL-35抑制CD4+CD25-T细胞表达IFN-γ，并提高CD4+CD25-Tregs比例。另外，目前与Bregs分化相关的关键转录因子仍在探索中，此前有研究发现转录因子Foxd3可直接结合并抑制IL-10启动子，从而抑制B细胞向IL-10+Bregs分化［11］。但大多数研究认为Bregs细胞亚群的分化并非由于Bregs谱系特异性因子的表达，而可能是由于免疫微环境中不同的刺激因素所致，在不同环境作用下，未成熟B细胞、成熟B细胞以及浆母细胞都具有分化为IL-10+Bregs的潜能［12］。研究表明，炎症微环境是Bregs激活/分化的先决条件，一些促炎症细胞因子，如IL-1β、IL-6、IL-21和GM-CSF，以及抑炎症细胞因子如IL-35对Bregs的分化有重要作用，除此之外，Bregs的分化还需要Toll样受体（TLRs）、CD40、B细胞受体（BCR）、CD80、CD86等细胞受体的介导［12-13］。

Bregs与其他免疫细胞之间的相互作用是目前免疫调控的研究热点之一。研究发现Bregs可通过抑制辅助性T细胞（T helper cells，Th cells）和树突状 细 胞（dendritic cells，DCs）的 功 能，以 及 诱 导Tregs，从而抑制炎症反应。在胶原诱导性关节炎（collagen-induced arthritis，CIA）小鼠模型中，Bregs可抑制Th1和Th17效应应答，并诱导产生分泌IL-10的调节性T细胞（Tr1）和FoxP3+Tregs，有效延缓疾病进展［6］。在WAS基因敲除（WAS-KO）小鼠中诱导RA后，Tregs和Bregs数量显著减少，伴有Th17细胞数量上升，而将野生型小鼠的Bregs转入WAS-KO小鼠可恢复其Tregs和Th17细胞数量的正常平衡［14］。IL-35可诱导产生分泌IL-10和IL-35的Bregs，将IL-35诱导产生的IL-10+Bregs注射入实验性自身免疫性葡萄膜炎（experimental autoimmune uveitis，EAU）小鼠模型体内，相比于注射IL-10-B细胞的EAU小鼠，注射IL-10+Bregs的EAU小鼠体内Tregs细胞比例随之上调，而Th1和Th17细胞比例下降，并可观察到炎症明显缓解［15］。除了IL-10之外，Bregs也可通过其他细胞因子发挥功能。Bregs可同时通过TGF-β/IDO通路和IL-10调节T细胞亚群的分化：TGF-β/IDO对效应T细胞的增殖起到抑制作用，同时在CTLA-4介导下促进Tregs扩增；而IL-10则起到抑制Th1反应的作用［9］。此外，Bregs表达的糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体（glucocorticoid-induced TNF-related protein，GITR）对于诱导并维持Treg细胞数量具有重要意义，而这一作用不依赖于IL-10［16］。

Bregs还可通过与DCs相互作用发挥免疫调节功能。例如，CD11bhighMHC-ⅡlowDCs通过CD40LCD40通路以及DCs分泌的IFN-β促进脾脏B细胞分化为CD19highCD32bhighBregs，后者能分泌高水平IL-10，无论在体外还是体内都能抑制CD4+T细胞增殖［17］。

2 Bregs与妊娠

正常妊娠并非是一个单纯的免疫抑制状态，而是复杂的局部和系统免疫调控过程。妊娠期多种激素作用在免疫调节中至关重要，雌激素（E2）、孕激素和人绒毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin，hCG）是主要调控激素，可抑制破坏性的免疫反应，诱导免疫耐受通路［18］，如妊娠期hCG可介导外周自然杀伤细胞（natural killer cell，NK）细胞毒作用下调，有助于维持母胎免疫耐受［19］。同样，B细胞也受妊娠期母体激素调控。研究发现，95%的CD24hiCD27hiB细胞表达hCG受体，孕妇外周血中的hCG可促进Bregs表达IL-10［20］。SUBRAMANIAN等［21］发现用E2治疗EAE小鼠后，可增加IL-10表达以及B细胞上负性共刺激分子PD-L1和B7.2的表达。此外，孕激素可促进Th2型免疫应答，减少促炎细胞因子的释放，增加IL-10表达［22］。以上研究结果表明，包括Bregs在内的B淋巴细胞在母体雌、孕激素及人绒毛膜促性腺激素的精密调控下，对母胎免疫耐受的形成和母胎界面交叉对话有重要的影响。在整个妊娠过程中，母体B细胞逐渐减少，但同时伴有祖B细胞、前B细胞、未成熟B细胞比例下降，成熟B细胞比例上调［23］，在妊娠早期，CD19+CD24hiCD27+Bregs比例上升，提示Bregs在早期母胎免疫耐受的形成中可能具有重要作用［20］；在妊娠晚期和分娩时，外周血中初始B细胞（naïve B cell）比例增加，而过渡B细胞（transitional B cells）和CD24hiCD38hi-Bregs比例下降，这可能与妊娠晚期激素水平波动有关，也可能是过渡B细胞和Bregs迁移至母胎界面所致［24］，但目前该假说尚未得到证实。

Bregs作为IL-10的重要来源，与产科预后密切相关。IL-10是与妊娠结局相关的抗炎细胞因子。缺乏IL-10可导致自发性流产、宫内生长受限，甚至死胎［25］。在妊娠子宫和胎盘都可检测到大量IL-10，即使是在早期妊娠阶段因父系抗原引起的炎症反应也可由于IL-10的存在而被削弱，因此IL-10被视为对抗促炎反应的关键细胞因子［26］。在妊娠状态下，耐受性树突状细胞与Tregs在IL-10和TGF-β的作用下形成免疫耐受微环境，一旦这些抗炎细胞因子如IL-10或TGF-β发生缺失，将影响诱导产生耐受性DCs和Tregs［27-28］。鉴于Bregs是IL-10和TGF-β的重要产生来源，其与Tregs及DCs的作用紧密联系。JENSEN等［29］研究发现，将分泌IL-10的B10细胞转移至自发性流产小鼠模型中，小鼠脾脏DCs保持未成熟状态，并诱导Tregs亚群比例显著上升，使小鼠母胎免疫耐受提高，从而改善自发性流产小鼠的妊娠结局。临床研究表明，Bregs数量及功能异常与复发性流产、反复着床失败（repeated implantation failure，RIF）等不良妊娠结局具有显著相关性［30］。在人类中，发生自发性流产的女性外周血中的CD19+CD24hiCD27+Bregs比例明显低于正常妊娠女性和未孕女性［20］。另外，研究发现妊娠期使用利妥昔（rituximab）单抗（一种抗CD20单克隆抗体，可清除B淋巴细胞）可致孕早期自然流产率提高［31］，这可能与早期清除CD20+Bregs有关，提示Bregs的负向免疫调控作用是提高早期妊娠成功率的不可或缺的因素，明确Bregs在妊娠中的免疫调节机制是十分必要的。

3 Bregs与SLE

目前围绕人类SLE的研究主要集中在免疫细胞以及抗体产生相关机制。自身抗体的产生是SLE的特征及诊断标准之一，其与自身抗原组成免疫复合物，可通过与Fc受体及补体结合，激活免疫系统，最终导致自身组织器官的损害。虽然自身抗体常见于SLE患者，但正常人群中也可出现高滴度的自身抗体却无SLE或其他自身免疫性疾病的临床表现，说明SLE的发生发展涉及多方面免疫紊乱，除了影响抗体生成外，还同时影响其他免疫效应过程［32］。

研究者通过对NZB/W F1狼疮模型小鼠的研究发现在不同时间用CD20单克隆抗体清除B细胞对病情的影响截然不同：在NZB/W F1小鼠12～28周用CD20单抗清除B细胞可延缓狼疮进展，延长小鼠生存期；而在NZB/W F1小鼠4周时用CD20单抗则加快疾病发生，降低生存率，这一差异与调节性B10细胞在早期即被CD20单抗清除有关［33］。进一步研究表明，缺乏CD5+CD1dhiBregs的NZB/W F1狼疮小鼠更早出现肾炎表现且生存期明显缩短，而将CD5+CD1dhiBregs过继转移至狼疮小鼠后可明显延长小鼠生存时间［34］，这说明B细胞作为多效性细胞，其中的Bregs亚群所发挥的负向调节功能在SLE的疾病进展中的作用不容小觑。另外，在MRL/lpr狼疮模型小鼠中也存在IL-10+Bregs比例降低，与炎症状态下B淋巴细胞刺激因子（B cell activating factor，BAFF）激活NF-κB和JNK信号通路从而介导B细胞向IL-10-B细胞分化有关，而阻断BAFF与其受体之间的作用后，MRL/lpr小鼠中IL-10+Bregs比例明显增加［35］。以上研究结果说明在狼疮模型小鼠中，Bregs数量异常对疾病进展可能起到关键作用。

研究表明在SLE患者中存在Bregs功能上的异常。SLE患者外周血中的CD24hiCD38hiB细胞数量与健康人群相比并无明显差异，但其中IL-10+Bregs比例显著降低，并且从SLE患者外周血提取的Bregs与健康人群的Bregs相比，前者抑制T细胞增殖的能力明显下降，说明SLE患者存在Bregs功能受损［36-37］。健康人外周血中的CD19+CD24hiCD38hiBregs在体外可通过IL-10以及CD80、CD86的介导抑制CD4+T细胞表达TNF-α和IFN-γ，但SLE患者的外周血中CD19+CD24hiCD38hiBregs无法抑制T细胞炎症因子的表达，且对CD40（对Bregs分化和功能起关键作用的表面分子）刺激无明显反应，而在其他风湿性疾病如干燥综合征及骨关节炎则无Bregs功能受损的表现［38］。CD19+CD24hiCD38hiBregs出现功能受损后，无法抑制初始T细胞分化为Th1和Th17，也无法诱导CD4+CD25-T细胞分化为具有免疫调节功能的Foxp3+Tregs［39］。此外，SLE患 者 的诱导性Bregs（induced Bregs，iBregs）对于Th细胞增殖的抑制作用也显著低于正常人的iBregs［40］。以上结果说明Bregs的抑炎功能受损是SLE发生发展的可能机制之一，其在SLE中具有一定的特异性，这也为SLE的靶向性治疗提供了新的方向。进一步研究发现，Bregs和浆细胞样树突状细胞（plasmacytoid dendritic cells，pDCs）之间的反馈调节异常是SLE潜在的发病机制。pDCs通过IFN-α释放和CD40-CD40L介导而诱导CD19+CD24hiCD38hiB细胞（未成熟B细胞）分化为表达IL-10的CD24+CD38hiBregs和浆母细胞，且高浓度IFN-α可使未成熟B细胞倾向于向浆母细胞分化，而IL-10可抑制pDC过度表达IFN-α［41］。但在SLE患者中，pDCs诱导分化CD24+CD38hiBregs的过程显著受抑制，这一作用与STAT1和STAT3激活改变相关［42］，说明在SLE中，Bregs和pDCs之间的免疫反馈调节存在功能障碍是Bregs细胞数量和功能异常的可能原因。

综上所述，Bregs可诱导并维持外周包括Foxp3+Tregs在内的抑制性CD4+T细胞数量，同时下调Th1、Th17介导的促炎反应，从而保持Th1/Th2反应的平衡，并与pDCs之间相互作用，对SLE也存在潜在的调节作用（图1）。

图1 Bregs对不同免疫细胞的影响Fig.1 Schematic diagram of effects of Bregs on different immune cells

4 Breg与妊娠合并SLE

妊娠合并SLE构成一个特殊的免疫困境：首先，妊娠过程本身已构成对母体免疫系统的挑战，这一过程需要免疫系统中不同的细胞亚群共同参与，进行双向免疫调控，从而达到相对“免疫抑制”状态；此外，SLE因其特征性的免疫调节失衡，造成自身抗体、多种促炎细胞因子过度表达；并且SLE病情活动度与激素水平相关，而妊娠期间的激素波动可能是触发狼疮活动的因素之一，对母体和胎儿带来相当大的风险。

无论是在妊娠状态下，还是在自身免疫性疾病、移植免疫耐受以及肿瘤微环境中，Bregs介导的免疫抑制作用是相似的［10］。Bregs通过诱导和维持Tregs数量、改变Th反应以及抑制效应细胞（包括细胞毒性T细胞、NK和DCs等）的作用而发挥免疫抑制效应（图1）［43-44］。在妊娠状态下，Bregs在母体激素的调控下与其他其他免疫细胞相互作用，维持母胎界面免疫微环境的稳定，而SLE患者常存在Bregs数量及功能紊乱，打破母胎免疫耐受，可能是造成不良妊娠结局的原因之一。

在一项研究中，对难治性SLE患者在孕前予以利妥昔单抗治疗，5例患者均在利妥昔单抗治疗后8～22个月内怀孕，其中有2例患者分别于孕31周和孕32周出现早产，并且1例患者从孕21周起尿蛋白逐渐升高，肾小球滤过率（eGFR）下降［45］，说明清除B细胞并不能完全有效控制孕期狼疮活动及改善妊娠结局，这也为靶向清除致病性B细胞而保留具有免疫调节作用的Bregs提供了支持。

此前研究表明，Tregs在SLE患者妊娠期发挥重要的免疫调节作用［46］。在SLE患者中，Tregs细胞数量和功能均存在损害，而Tregs可抑制Th1、Th17分泌促炎细胞因子，在维持母体免疫耐受方面发挥重要作用［47］。根据目前研究表明，Bregs对T细胞的调节具有双重作用：其一，Bregs通过抑制CD4+T细胞分化为Th1和Th17从而减少过量促炎因子的释放；其二，Bregs可诱导效应T细胞转化为Tregs而发挥T细胞对免疫应答的负向调节作用［39］。虽然目前Bregs在妊娠合并SLE中的存在状态及作用机制仍需进一步研究，但随着Bregs细胞在免疫调节中所起的作用逐渐为人所知，其对Tregs及其他免疫细胞的调控作用可为孕期狼疮活动的相关机制提供新的研究思路，也提示了以Bregs作为靶点的治疗策略具有潜在的应用价值。

5 小结与展望

Bregs的负向调节免疫应答功能在妊娠状态下及多种自身免疫性疾病如RA、SLE中的作用不容忽视，但目前对于Bregs的研究仍面临较多问题，Bregs的表型及分化发育过程目前仍不甚明了，其作用机制有待进一步思考与探究。在妇产科及风湿科等多学科的共同努力下，SLE妊娠已不再是禁忌，但其特征性的免疫失衡为母体和胎儿都带来巨大的风险，因此妊娠合并SLE仍应被视为高危妊娠。SLE患者中存在Bregs数量及功能异常，使得Bregs难以正常发挥负向免疫调节功能，进一步促进免疫失衡，对胎儿所需的母体免疫耐受环境构成挑战。因此，随着对Bregs与妊娠合并SLE的关系进行深入探究，不同Bregs亚群所特有的细胞标记、其分泌的细胞因子及与其他免疫细胞的作用通路可成为SLE治疗的突破点，并可为妊娠期狼疮活动机制提供一个新的研究方向，这将有助于开拓对SLE相关不良妊娠结局的预防及干预策略。