文冠果根系固氮菌的分离与鉴定

张东旭，张永芳，刘淑娇，李守科

（1.山西大同大学农学与生命科学学院，山西大同 037009；2.朔州职业技术学院，山西朔州 036002；3.山东沃奇农业开发有限公司，山东潍坊 261000）

文冠果（Xanthoceras sorbifolium）又名木瓜，木瓜瓜，是无患子科文冠果属一种落叶灌木或小乔木，主要分布在中国北方的黄土地貌区，山西省是其核心分布区之一[1]。文冠果是一种强阳性树种，有耐干旱、耐盐碱、耐严寒、耐瘠薄、抗病虫等优点[2]，但其根系肉质，有耐涝性差、扎根性差等缺点。因此只要土壤疏松透气、排水良好，在北方地区的广大的平原、丘陵、荒坡、戈壁、沙漠、黄土沟壑均可种植[3]。目前，由于我国耕地面积的有限和对粮食安全的需要，文冠果的栽培大部分是在农林生产的边际地上进行；但是，边际地往往存在水分和养分不足等缺点，不利于文冠果高产稳产。2014 年，课题组山东省的一个文冠果基地中，发现少数文冠果植株的根系有根瘤。如果其中存在某种根瘤菌且具有生物固氮能力，则可在文冠果育苗时人工接种根瘤菌，改善文冠果自身对氮素的吸收能力，促进文冠果规模化种植。

张烨等人（2010）在文冠果一、二年生植株根系分离到7株内生菌，其中一年生文冠果根系主要内生菌为成团泛菌(Pantoea agglomerans)、根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)和产酸克雷伯菌(Klebsi-ella oxytoca)，二年生文冠果根系主要内生菌为假单胞菌属(Pseudomonas)细菌，其中6 株有固氮活性[4]。卫旭芳（2017）从文冠果根系瘤状物分离到9 株外观形态、质地、颜色各不相同且生长速度较快的菌株[5]，郝莎莎等（2018）对这9株菌株的分子鉴定表明，其中6株属于芽孢杆菌属(Bacillus),2株属于短芽孢杆菌属(Brevibacillus),1 株属于假单胞菌属(Pseudomonas)，未发现有固氮活性菌株[6-7]。本实验旨在比较有根瘤根系和无根瘤根系中内生菌在数量与种类上的不同，找出有根瘤根系中能够固氮的内生菌，为文冠果的优质丰产栽培和文冠果根系内生固氮菌的应用提供一些理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

文冠果有根瘤根系与无根瘤根系（图1）。主要试剂有75%的酒精、1%的NaClO、无菌水、蒸馏水、YMA固体培养基（少氮培养基）、Ashby固体培养基（无氮培养基）、高氏一号培养基（无氮）、高氏一号培养基（有氮）等。

图1 文冠果根系无根瘤（左）和有根瘤（右）

1.2 实验方法

1.2.1 文冠果根系的预处理

将有根瘤根系和无根瘤根系分别用自来水冲洗，洗去泥土，然后将清洗干净的根系分别剪切在两个烧杯中。在超净工作台中，用1%NaClO 溶液浸泡1～3 min,再用75%的酒精消毒1 min。用无菌水冲洗5～6次。

1.2.2 根系外生菌的培养及分离

在最后一次冲洗时，用移液枪吸取冲洗过根系的无菌水，将无菌水分别涂布于YMA（有氮）、Ashby（无氮）、高氏一号有氮和无氮培养基平板上，各涂布1 个平板，设置为对照（依次为CK1、CK2、CK3、CK4），将涂布有无菌水的培养基放在培养箱中在25 ℃培养3d。若有微生物长出来表明这些菌是根系外生菌，在内生菌分离时要考虑到这部分微生物可能是外生菌或内外兼生菌。如无微生物长出表明根系消毒彻底。

1.2.3 内生菌菌液的培养及分离

内生菌的分离及接种：

①提取：用无菌剪刀将预处理过的有根瘤和无根瘤根系剪成小段，分别置于两个研钵中，各加入些许石英砂，研磨。当完全研碎后加入少量的无菌水，搅拌形成悬浮液。将悬浮液放入2 mL的离心管中进行低速离心（750 r/min）8 min。②接种：接种前先开紫外等照射超净工作台15 min,然后关闭紫外灯，点燃酒精灯在火焰旁无菌区开始接种，用涂布法接种，每个培养皿用移液枪定量加入100 μL 上清液，用涂布棒均匀涂开。所有的培养皿都接种完成后，用封口膜封口。

内生菌的培养及纯化：

①培养：YMA 培养基平板置于26 ℃下培养5～7d。高氏一号有氮培养基平板置于28 ℃下培养5～7d。高氏一号无氮培养基平板置于28 ℃下培养10d。Ashby 培养基平板置于28oC 培养15d。待各培养皿培养时间达到后取出观察并记录菌落生长情况，给菌落照相。②纯化：对菌液进行培养后长出了菌落，分别重新配制培养基，利用平板画线法对养皿上的菌落进行纯化，纯化3代以后记录菌落的形态并将分离所得的菌种拍照，将在Ashby培养基上分离的两个菌种委托北京三博远志生物技术有限责任公司进行16S rDNA分子生物学鉴定。

2 结果与分析

2.1 文冠果根系内生菌的分离与纯化

根据菌落形态观察，在YMA 有氮培养基上得到了11 种菌，其中8 种是从有根瘤根系中分离得到，3 种是在无根瘤根系中得到的。在高氏一号有氮培养基上分离得到了3 种菌。在Ashby 无氮培养基和高氏一号无氮培养基上都有菌落长出，其中Ashby 培养基分离出4 种固氮菌，有根瘤根系和无根瘤根系上清液在无氮Ashby 培养基上各长出了2 种菌落，都为透明的菌落，且布满了培养皿（图2）。

图2 有根瘤和无根瘤根系在Ashby(无氮)培养基上得到的菌落最后纯化得到的菌落

2.2 文冠果根系内生菌的分子鉴定

将Ashby 培养基长出的菌纯化后，编号sjj-1-a和sjj-1-b(有根瘤根系获得)和sjj-2-a 和sjj-2-b(无根瘤根系获得)委托北京三博远志生物公司进行分子生物学鉴定。sjj-1-a 和sjj-1-b 测得序列长度分别为1 129 个和1 106 个碱基对。sjj-2-a 和sjj-2-b 测得序列长度为1 129 个和1 134 个碱基对。登陆http//:www.ncbi.nlm.nih.gov，将测定得到的16S rDNA 序列用核酸BLAST 程序进行同源性比较（表1）。

表1 鉴定菌株16S rDNA序列在NCBI数据库在线Blast结果（仅显示前3条记录）

由表1可见，从文冠果有根瘤根系中分离出的固氮菌株sjj-1-a和sjj-1-b在NCBI核酸数据库匹配度最高的序列，其匹配率均低于40%，E 值均大于零，平均识别率均低于97%，由此可以鉴定为2株新菌种。其中sjj-1-a 与多种非培养细菌有更好的识别率，sjj-1-b则与根瘤菌、绿色绿芽菌有更好的识别率。由此可以判断sjj-11-a可能是一种之前研究尚未培养出来的细菌，而sjj-1-b则可能是根瘤菌新菌种。从无根瘤文冠果根系中分离出的固氮菌株sjj-2-a 与多个根瘤菌株系匹配率等于99%，E值等于零，平均识别率大于97%，初步认定其是一株固氮菌；sjj-2-b 则与多个根癌土壤杆菌株系匹配率在98%～99%之间，E值等于零，平均识别率大于95%，但小于97%，由此可以初步判断sjj-2-b是一个根癌土壤杆菌新菌种。

3 结论

本研究从文冠果有根瘤和无根瘤根系分离得到20 种内生菌，其中包括6 种固氮菌。Ashby 培养基分离出4 种固氮菌，高氏一号无氮培养基分离出2 种固氮菌。将Ashby 培养基上分离纯化的4 种固氮菌经16S rDNA 部分序列测序及NCBI数据库比对，发现3株为新菌种，1 株为已知根瘤菌新菌株。这4 种菌在无氮细菌培养基的长势很旺盛，在没有氮源的培养基上可以生长说明这两种菌株有固氮能力。另外2株固氮菌在无氮高氏一号培养基上可以，菌落分别呈紫色和无色透明。由于生长速度较慢，尚未做16S rDNA 鉴定。文冠果有根瘤根系和无根瘤根系中均有固氮菌和根瘤菌被发现。

4 讨论

目前，已经在许多非豆科植物的根系中发现有结瘤现象，如赤杨(alnus japonica)[8]、苏铁(cycas revoluta)[9]、杨梅(myrica rubra)[10]以及胡颓子科(elaeagnaceae)的翅果油树（elaeagnus mollis）、沙棘(hippophae rhamnoides)、沙枣（elaeagnus angustifolia）、川滇桤木（alnus ferdinandi-coburgii）[11]等植物，这些植物主要是与放线菌中的弗兰克氏菌（frankia）之间的结瘤共生的。此外，裸子植物的罗汉松（podocarpus macrophyllus）和鸡毛松（podocarpus imbricatus）、木黄麻属（casuarina adans）的一些杂草类是通过豆科植物根瘤菌类型的细菌结瘤的[[12]。张烨等人（2010）曾在文冠果一、二年生植株根系分离可以生物固氮的根癌土壤杆菌(a.tumefaciens)和产酸克雷伯菌(k.oxytoca)[4]。但是，本研究从无患子科的文冠果中分离鉴定的4 个固氮菌，没有一个是弗兰克氏菌。其中，有一个根癌农杆菌新菌种（sjj-2-b），一个是根瘤菌新菌种(sjj-1-b)，一个普通根瘤菌新菌株(sjj-2-a)，一个则与非培养细菌HC18-11B26 更为相似（sjj-1-a），但在本研究种处于可培养状态。根瘤菌新菌种(sjj-1-b)是不是一种文冠果特有的根瘤菌或者是一个新的豆科植物根瘤菌，其能否使得文冠果根系结瘤，固氮能力如何，对抗生素抗性如何，对盐分胁迫抗性如何，均需进一步研究。总之，文冠果是一种经济价值极高木本油料树种，若能分离出一种能够使其根系结瘤且具备固氮能力的共生根瘤菌，则将对文冠果边际地造林和产业发展都具有重要意义。