肝细胞极性调控

毛元鹏，魏红山,2

1 北京大学地坛医院教学医院 消化科，北京 100015；2 首都医科大学附属北京地坛医院 消化科，北京 100015

细胞极性是多数细胞维持正常生理生化功能的必需属性。无论是上皮细胞，还是不对称分裂细胞，均高度依赖细胞极性以维持其正常功能[1]。1926年，Bunting等[2]发现机械张力决定着正在发育的分裂期成纤维细胞的极性和空间位置。从最简单的无脊椎动物，到脊椎动物上皮细胞的结构分布，均存在不同形态的细胞极性。许多极性决定因子具有肿瘤抑制或促癌作用，并且在各种不同的肿瘤细胞中表达异常[3]。肝细胞具有特殊的细胞极性，并且其极性的稳定性与多种肝病相关，其中的极性调控分子机制仍有待阐明。

1 对肝细胞极性的认识过程

肝实质细胞是肝脏的主要功能细胞，是高度特化的极性上皮细胞。1975年，Evans等[4]报道了对大鼠肝细胞表面膜功能极性的研究，这是较早有关肝细胞极性的相关研究。随后，研究人员在新鲜分离的大鼠肝细胞中发现，细胞极性丧失的同时，细胞间连接结构也无法检测到，提示细胞间连接与肝细胞极性之间有着重要联系。1993年，研究人员进一步发现Disse间隙中的细胞外基质(ECM)控制着肝细胞极性的发展。得益于过去数十年的深入研究，目前对肝细胞极性的认识已有了重大进展，众多相关蛋白分子及结构成分被逐渐揭示。然而，更为全面的肝细胞极性调控分子机制研究仍然有待进一步完善。

2 影响肝细胞极性的结构特征

肝细胞极性分为结构极性和功能极性。每个肝细胞表面可分为窦状隙面、肝细胞面和胆小管面，肝细胞极性机制便体现在细胞形态和功能上。肝细胞通过窦状隙面与血液循环进行物质交换，从胆小管面分泌胆汁，而肝细胞面则参与细胞间接触。为了介导这些功能，肝细胞形成不同的极化腔域，并通过紧密连接(tight junction，TJ)隔开[5]。一旦肝细胞极性受到破坏，肝细胞的物质交换、胆汁分泌等重要生理功能将会发生障碍，导致多种肝脏疾病的发生。ECM的稳定性以及细胞间连接是决定肝细胞极性的关键，多蛋白及其复合体参与了肝细胞极性的维持。

2.1 细胞间连接 上皮细胞主要有3种细胞间连接方式：TJ、黏附连接(adherens junction，AJ)和桥粒。在单细胞培养实验中发现，单细胞呈现出无极性状态，提示细胞极性的建立和维持依赖细胞间连接的存在。

TJ是位于细胞-细胞接触最顶端区域的上皮细胞间连接，由跨膜蛋白和将连接复合物与细胞骨架连接的胞质蛋白组成，包括密封蛋白-1(claudin-1，CLDN1)，连接黏附分子，闭锁连接蛋白1、2、3等。TJ的组装通过调节膜蛋白的极化定位，维持细胞极性的稳定，并产生电化学浓度梯度，从而维持上皮细胞的物质运输功能[6]。此外，TJ还充当极性信号蛋白的支架，包括Par3/Par6/非典型蛋白激酶C(atypical protein kinase C，aPKC)复合物和Crumbs/PALS1/PATJ复合物，从而在细胞极性中发挥作用。最近研究[7]发现，TJ蛋白Par3通过与小GTPase Cdc42合作将aPKC靶向至细胞-细胞接触中心附近以组织肝细胞极化。

AJ由上皮细胞钙黏蛋白、α-catenin和β-catenin等组成，对上皮细胞极性的产生和维持起着重要作用。钙黏蛋白是AJ的关键成分，其下调可引起AJ的破坏，进而导致细胞极性丧失，在多种肿瘤中发挥促进肿瘤侵袭的作用[8]。

细胞间连接将上皮细胞连接在一起形成结构和功能的连续体，连接的完整性决定了上皮细胞正常功能的行使，而连接的缺陷将导致组织的广泛异常，破坏体内平衡，继而引发各类疾病。

2.2 细胞外基质(ECM) ECM是一种复杂的大分子网络结构，负责维持组织的结构完整性并调节细胞和组织功能[9]。肝细胞中极性和功能的成熟依赖于细胞-ECM之间的相互作用。在体外实验中，肝细胞在塑料上培养不表现出极性，而在ECM培养中有极性表达。而且，ECM-细胞-ECM形成的“三明治”结构对细胞极性的产生和维持起着关键作用。显然，作为ECM骨架结构的胶原蛋白空间是构成ECM的核心。前期笔者团队[10-11]对肝星状细胞的功能调控研究即发现，抑制O-糖基化修饰可加重肝损伤，并对胶原蛋白表达具有直接的抑制作用。近期，笔者团队[12-14]研究发现，抑制胶原蛋白的Glcα1和2Galβ1-糖基化修饰可导致肝细胞损伤及胶原分泌障碍及脂质代谢异常；进一步观察发现小鼠胚胎致死(E11.5)，伴有肝脏等中胚层发育异常。体外胶原蛋白夹层培养实验[15]表明，ECM蛋白与某些生长因子在特定区域的定位是肝细胞极性表型发育所必需。

2.3 极性蛋白复合体 上皮细胞顶-底极性复合体主要包括Scribble复合体、Crumbs复合体以及Par复合体，这些极性蛋白复合体在细胞极性的建立和调控上发挥着重要作用。

Scribble复合体位于上皮细胞基底膜，由Scrib、Lgl和Dlg 3种蛋白组成，与细胞极性的建立有关。正常肝脏组织中，Scrib蛋白主要表达于细胞膜上；而在肝脏肿瘤中，Scrib蛋白呈高表达状态，并主要表达于细胞质和细胞核[16]。研究[17]显示，肝细胞癌(HCC)患者肝脏Scrib蛋白过表达与患者的不良预后相关，Scrib蛋白过表达并富集于胞质，引起细胞极性异常，促进了HCC发展和转移。

Crumbs复合体位于顶端结构域，包括跨膜蛋白Crumbs和胞内信号接头蛋白PALS1、PATJ。Crumbs复合物与上皮极性和细胞连接形成相关，在HIPPO通路中是重要的上游调节剂。Crumbs蛋白对细胞极性的影响与一些氨基酸位点有关，第7位精氨酸对Crumbs招募膜突蛋白和β-spectrin有作用从而影响AJ形成[18]，第6位和第9位氨基酸影响顶部决定因子之间的正反馈以及顶-基底之间决定因子的相互拮抗[19]，从而影响细胞顶-底极性的建立。

Par复合物，包括Par3-Par6-aPKC复合物，在进化上十分保守，与TJ的建立有关。Par蛋白家族包括Par1～6，各自具有不同结构域及功能。Par3作为Par3/Par6/aPKC复合体的中心组织者，对细胞极性的建立和维持至关重要。Par3的缺失将导致PAR复合物的分离和上皮极性的丧失。转录因子SNAIL家族蛋白——SNAI1 是促进上皮特征(包括极性和连接)丧失的关键因素。SNAI1蛋白不稳定，aPKC介导的SNAI1磷酸化促进SNAI1蛋白降解，使内源性SNAI1蛋白失稳，从而维持上皮特征，防止上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)发生[20]。因此，Par复合物缺失介导的极性破坏可能通过SNAI1促进体内肿瘤的侵袭和转移[21]。

目前，已经在多种人类癌症中发现极性蛋白复合物的异常，提示极性蛋白的改变不仅破坏细胞极性，并对癌症的发生发展可能有直接的影响。

3 研究肝细胞极性的细胞学模型

随着各种生物技术的发展，肝细胞的培养技术日渐成熟。然而，传统的3D培养无法有效保持肝细胞极性。Jia等[22]采用微流控芯片三维培养技术与天然海藻酸盐水凝胶相结合，通过借鉴肝细胞在肝脏的极性肝板排列，及其与非实质细胞、ECM相互作用的仿生学原理，构建模仿肝板的3D肝组织，从而有效保持肝细胞极性。在该培养技术中，肝细胞的功能、极性蛋白的表达均随着培养时间的增加而得到增强，表明该技术可以提供更好的体外3D培养平台，可用于药物开发、肝细胞极性研究等。

在既往研究中，关于肝细胞极性的组成和机制均在极化细胞(HepG2、WIF-B、和犬肾细胞等)中确定。近些年来，不断有新的极性功能实验在多能干细胞中进行，并且取得了重大进展。多能干细胞是一类具有自我更新、自我复制能力的多潜能细胞，具有分化为多种细胞组织的潜能。诱导多能干细胞衍生的肝细胞样细胞(hepatocyte-like cell，HLC)可以提供一个新的选择来满足极化肝细胞培养模型的需求。HLC通常在2D培养条件下在培养皿中分化，这一过程效率低下且产生的HLC不成熟，缺乏关键的体内特征，包括细胞极性。最近有研究[23]报道一种基于干细胞分化，使用TransWell滤过器生成柱状极化HLC的方案，并证实极化HLC定向分泌物质。这种新颖的干细胞分化方案提供了一个强大的细胞培养系统来研究适当的肝细胞功能，这不仅有利于更好地了解正常的肝脏生理，而且还能进一步了解极性相关肝病的发病机制。值得注意的是，在HLC培养过程中，细胞间相互作用是诱导细胞极性和功能成熟的重要因素[24]。

4 肝细胞极性调控相关信号通路

肝细胞极性的调节不仅表现在各种结构成分的组成上，同样重要的还有发生在细胞内外的复杂的分子信号通路。在整个尚未完全阐明的信号网络中，介绍以下几种主要通路。

4.1 AMP依赖的蛋白激酶(adenosine 5′-monophosphate-activated protein kinase，AMPK)相关信号通路 TJ是维持细胞极性的关键因素之一，而AMPK在其中发挥着关键作用。现有研究[25]表明，当AMP/ATP比值升高时，可以通过肝激酶B1磷酸化激活AMPK，促进上皮细胞之间的TJ形成。此外，AMPK还可以影响胆汁分泌。胆汁酸具有信号分子的作用，可升高细胞内环磷酸腺苷水平。2000年，Ng等[26]首先报道了胆汁酸促进肝细胞极化的现象，发现胆汁酸能够对大鼠肝癌细胞极性进行可逆性诱导。此外，Fu等[27]使用大鼠原代肝细胞的胶原夹心培养物，评估牛磺胆酸对初级肝细胞夹心培养模型中极性发展的影响，确定了牛磺胆酸盐可通过激活环磷酸腺苷-Eapc-Rap1-丝裂原活化细胞外信号调节蛋白激酶-肝激酶B1-AMPK 通路影响肝细胞极性，表明胆汁酸产生和肝细胞极性之间存在关联。此外，AMPK还是一种调节能量稳态的细胞能量传感器，可通过协调多种细胞器及细胞过程以维持肝细胞极化过程的能量需求[28]。

4.2 Wnt/β-catenin通路 经典的 Wnt/β-catenin通路是一种十分保守的信号传导机制，可调节许多关键的生理和病理过程(细胞增殖、分化和极性)。β-catenin通过与α-catenin结合将上皮钙黏素(E-cadherin)与肌动蛋白细胞骨架连接，在AJ中发挥作用。在特异性敲除β-catenin的肝细胞中，可观察到γ-catenin基因表达保持不变，但其丝氨酸/苏氨酸磷酸化水平明显增加，以补偿AJ处β-catenin的缺失[29]。而肝细胞中β-catenin和γ-catenin的双重丢失，可引起TGFβ通路的激活，进而下调肝细胞核因子4α(hepatocyte nuclear factor 4alpha，HNF4α)的水平和活性，从而导致肝细胞极性的丧失[30]。

4.3 抑瘤素M(oncostatin M，OSM) OSM是IL-6家族的多效性细胞因子，可由多种类型细胞产生。OSM参与多种生物过程(造血、成骨、肝脏发育等)。在胚胎中，非极化的肝母细胞在OSM和TNFα的信号刺激下分化为极化的肝细胞[31]。OSM介导的K-ras信号通过改变包括 E-cadherin和β-catenin在内的TJ相关蛋白亚细胞定位来诱导AJ形成。在转染人重组OSM的HepG2细胞中，观察到EMT过程相关变化，如细胞间接触广泛丧失以及E-cadherin表达下调[32]，提示OSM介导的信号通路与肝细胞极性的调节有关。

5 转录因子对肝细胞极性的影响

HNF4α作为一种转录因子，对哺乳动物肝脏发育过程中的肝细胞分化必不可少。HNF4α表达失调与多种肝病(肝硬化、HCC)有关[33]。缺乏HNF4α的肝细胞没有进行正常的细胞接触，细胞黏附和连接发生广泛障碍，导致肝体积增大并伴有明显的脂肪变性[34]，提示HNF4α能够通过调节黏附及连接相关蛋白表达水平进而影响肝细胞极性的维持。此外，在HCC肝组织中，HNF4α表达显著降低，HCC中细胞-细胞和细胞-ECM黏附减少，细胞极性丧失，端粒酶活性增加以及肝脏特异性基因表达受到抑制[35]。

6 微小RNA(microRNA，miRNA)对肝细胞极性的影响

miRNA是一种非编码小RNA，通过与mRNA结合而干扰翻译过程。miRNA能够影响AJ和TJ蛋白的表达以及细胞骨架重塑。但是，关于miRNA在肝细胞极性的建立和维持中的具体作用及相关机制尚不清楚。在HCC患者癌组织中，多种miRNA表达水平发生改变。研究[36]发现，miRNA-144可通过与牛磺酸上调基因1相互作用激活JAK2/STAT3通路，促进HCC细胞的增殖和转移，而牛磺酸上调基因1敲低通过使JAK2/STAT3通路失活上调miRNA-144来抑制HCC肿瘤生长。

7 肝细胞极性与肝脏疾病

7.1 病毒性肝炎 研究[37]发现，在HCV感染的HepG2细胞中，HCV与细胞两侧端均有结合，但感染主要发生在基底外侧区域，且新合成的子代病毒优先从基底外侧区域释放。另有研究[38]证实，TJ蛋白在HCV感染过程中发挥重要作用。HCV进入肝细胞与多种因子相关，包括B1型清道夫受体(scavenger receptor B1，SR-B1)、分化簇81、表皮生长因子受体、CLDN1和闭合蛋白。

CD81缺少膜信号序列，但可聚集在细胞膜微区中，并参与多种细胞功能，如细胞黏附、迁移和增殖等。但值得一提的是，与其他宿主因子(如低密度脂蛋白受体或SR-B1)的相互作用可能需要诱导HCV糖蛋白E2的构象变化以暴露CD81结合位点。SR-B1作为脂蛋白受体，可直接与E2结合发挥作用。LDLR不与E2结合促进病毒摄入，而是与HCV脂质病毒颗粒中的天然配体低密度脂蛋白结合促进病毒RNA的复制。CLDN1可以与HCV糖蛋白E1/E2异二聚体结合，同时可以与CD81结合形成复合体，促进病毒内吞过程。HCV最初附着于表面蛋白多糖和脂质受体上如SR-B1和CD81。当病毒渐渐靠近TJ处时，CLDN1和闭合蛋白对病毒的入吞至关重要[39]。

7.2 肝细胞癌(HCC) 大多数癌症是上皮细胞形成的，而极性的缺失被认为是癌症的标志和先决条件[40]。肝细胞极性的紊乱和丧失导致细胞黏附和连接的减弱，诱导EMT，最终促进HCC的发展和转移。其中，E-cadherin作为AJ的主要成分之一发挥着关键作用。E-cadherin在肝癌中的下调可由不同的机制引起。CD147是一种Ⅰ型跨膜糖蛋白，在肝肿瘤细胞中高表达，主要分布在细胞基底外侧。CD147不仅能够促进TGFβ1介导的肝细胞极性丧失，还能够通过激活Src募集泛素连接酶直接诱导E-cadherin的泛素化和溶酶体降解，导致极性蛋白Par3表达减少和黏性连接蛋白β-catenin核易位，从而促进肝细胞去极化[41]。空泡蛋白分选蛋白33B(vacuolar protein sorting 33B，VPS33B)在维持肝细胞极性和HCC发生发展中也起着关键作用。VPS33B与肝细胞顶-基底外侧极性调节蛋白VIPAR、囊泡转运蛋白Sec22b和筏蛋白-1相互作用，调节和维持极性蛋白的分布。当VPS33B缺失时，可导致E-cadherin蛋白水平的降低，诱导肝损伤、进行性肝炎、肝纤维化和HCC[42]。此外，神经生长因子是一种重要的神经营养因子，对神经元细胞的生长和存活至关重要。有研究[43]在构建稳定过表达神经生长因子的HepG2细胞系后，观察到HepG2细胞中神经生长因子过表达可破坏细胞极性，从而启动EMT并促进癌细胞运动。上述证据提示，肝细胞极性稳定受到破坏后，可促进HCC的发展、浸润和转移。

7.3 胆汁淤积性肝病 胆汁淤积性肝病是指由于胆汁的生成、分泌或流动发生障碍，导致肝内外胆管中胆汁积聚，进而造成肝损伤。如前所言，肝细胞极性是肝细胞正常行使功能的基础，而肝细胞的一项重要功能即为负责产生和分泌胆汁。如果肝细胞极性稳定受到破坏，肝细胞内蛋白质定位发生异常，将导致肝细胞无法正常分泌胆汁，胆汁分泌量减少。胆汁盐从肝脏的转运是由位于小管膜上的胆盐输出泵介导的，胆盐输出泵缺乏往往是进行性家族性肝内胆汁淤积症2型的主要原因[44]，患者往往在几年内进展为终末期肝病。此外，TJ蛋白异常也将导致胆汁淤积性肝病的发生。TJ蛋白2(TJP2)基因突变及其翻译产物ZO-2缺乏可引起严重的肝内胆汁淤积[45-46]。驱动蛋白超家族是一类在胞内负责运输物质的分子马达，与细胞极性有关。致病性驱动蛋白超家族成员12变异引起肝细胞极性紊乱，可导致胆汁淤积性肝病的发生[47]。胆汁淤积性肝病的发病机制往往被认为是肝细胞极性紊乱的结果，目前已经确定多种蛋白质/基因与肝细胞极性紊乱所致胆汁淤积性肝病相关，详见表1。

表1 肝细胞极性紊乱所致胆汁淤积性肝病相关蛋白质/基因

8 展望

肝细胞极性的建立和维持涉及多种蛋白质分子及信号通路，了解其中具体分子机制对于与肝细胞极性相关疾病的预防和治疗有着重大意义。众多蛋白质分子在行使其正常功能前，需在胞质内质网中完成翻译后修饰这一过程，包括糖基化、磷酸化、甲基化等修饰形式。葡萄糖基-半乳糖基-羟基化是一种重要的翻译后修饰，主要在含有胶原蛋白样结构域的蛋白质中观察到，如胶原蛋白、脂联素等。前胶原半乳糖基转移酶1是前胶原蛋白进行葡萄糖基-半乳糖基-羟基化的一种糖基转移酶，负责将半乳糖基转移至前胶原蛋白特定羟化赖氨酸残基上。此外，包括钙黏蛋白在内的多种细胞连接蛋白也需要进行N-糖基化等翻译后修饰。由于胶原蛋白和蛋白聚糖是构成ECM的核心结构，蛋白质的糖基化修饰可能是决定肝细胞极性发育及维持的关键。肝细胞小生境(niche)功能调控研究，在很大程度上决定了肝细胞极性的调控，其中胶原蛋白Glcα1和2Galβ1-等O-糖基化修饰对ECM小生境的影响，可能是未来肝细胞极性分子机制阐述的重要研究方向。

利益冲突声明：所有作者均声明不存在利益冲突。

作者贡献声明：毛元鹏负责拟定写作思路，资料分析，撰写论文；魏红山负责课题设计，指导撰写论文并最终定稿。