碱溶性茯苓多糖的抗氧化作用
2022-11-16罗卓雅谭宏渊谢佳琳田帝胡婷吴鹏
罗卓雅，谭宏渊，谢佳琳，田帝，胡婷，吴鹏
（黄冈师范学院生物与农业资源学院，湖北 黄冈 438000）
茯苓（Poria cocos）系多孔菌科真菌茯苓，被誉为中药“四君八珍”之一，为国家药食同源中药材品种[1]。茯苓多糖是茯苓菌核中占比较高的生物活性成分[2]。国内外研究表明茯苓多糖具有多种功能特性[3-6]，如增强细胞免疫反应、抗肿瘤、抗氧化、抗炎等[7-10]，其在食品加工及医药领域的应用较为广泛。
目前，提取茯苓多糖的方法有很多，如复合酶法[11]、微波辅助提取法[12]、热水浸提法[13]等。复合酶法提取茯苓多糖，虽然效果好，但对酶解条件要求较高；微波辅助法提取茯苓多糖，提取率高，但温度和时间都需要精准控制；热水浸提法提取茯苓多糖，提取时间长且提取率较低。本试验利用碱液提取茯苓多糖，并采用傅里叶红外光谱和紫外可见分光光谱对碱溶性茯苓多糖的结构进行初步表征，再以VC为对照，对其体外抗氧化能力进行研究。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
九资河茯苓：市售；氢氧化钠（分析纯）：天津博迪化工股份有限公司；乙二胺四乙酸、维生素C（VC）、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、邻苯三酚、水杨酸、磷酸氢二钠、柠檬酸、铁氰化钾、三氯乙酸、氯化铁、三羟甲基氨基甲烷[tris（hydroxymethyl）aminomethane，Tris]（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
高速万能粉碎机（DFT-200C）、真空冷冻干燥机（FDU-1200）：上海比朗仪器有限公司；数显恒温水浴锅（HH-6）：金坛市顺华仪器有限公司；台式高速离心机（TG16-WS）：湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；紫外可见分光光度计（UV-2600）：岛津仪器有限公司；傅里叶红外光谱仪（Nicolet-6700）：美国热电有限公司。
1.3 方法
1.3.1 碱溶性茯苓多糖的提取
1.3.1.1 茯苓粉制备
将茯苓块洗净烘干12 h后，用高速万能粉碎机粉碎，过60目筛，即得茯苓粉。
1.3.1.2 碱液浸提
将浓度为0.6 mol/L的NaOH溶液与茯苓粉按照50∶1（mL/g）的液料比在 4 ℃恒温水浴锅中浸提 1 h[14]。碱液浸提结束后，取上清液，配制0.5 mol/L的盐酸对其进行中和，调节pH值为7，避免多糖在碱性条件下发生水解。
1.3.1.3 离心
中和后的多糖提取液在8 000 r/min条件下离心10 min，去除上清液，得到多糖沉淀。
1.3.1.4 真空冷冻干燥
采用真空冷冻干燥机，在-60℃～-50℃条件下将多糖沉淀真空冷冻12 h，即得碱溶性茯苓多糖。
1.3.2 傅里叶红外光谱分析
利用傅里叶红外光谱仪，在400 cm-1～4 000 cm-1波数下采用KBr压片法对碱溶性茯苓多糖样品进行扫描分析[15]。
1.3.3 紫外可见分光光谱分析
利用紫外可见分光光度计，通过固体样品扫描法对碱溶性茯苓多糖样品进行扫描[16]，扫描波长为190 nm～600 nm。
1.3.4 抗氧化能力测定
1.3.4.1 还原能力的测定
在5支试管中分别加入2.5 mL不同浓度的多糖样品溶液[17]、2.5 mL pH6.6磷酸盐缓冲溶液，混匀后，加入2.5 mL的1%铁氰化钾溶液，摇匀后于50℃水浴20min。加入2.5mL的10%三氯乙酸溶液，于3000r/min离心10 min后，取上清液5 mL，分别添加5 mL蒸馏水和1 mL的0.1%三氯化铁溶液，于700 nm测定吸光度A[18]。以蒸馏水替代样品溶液作为空白组，于700 nm测定吸光度A0，每个样品平行测定3次，取平均值，以VC为对照。还原能力（ΔA）计算公式如下。
1.3.4.2 DPPH自由基清除能力测定
在5支试管中分别加入不同浓度多糖样品溶液2.5 mL，再加入2 mL的0.15 mmol/L DPPH-乙醇溶液[19]，摇匀后静置30 min，测定其吸光度（AX）；以2 mL无水乙醇代替样品溶液后测定其吸光度（A0）；取等浓度的样品溶液与相等体积无水乙醇混合，测定其吸光度（AX0）。试验平行测定3次，取平均值，以VC为对照。DPPH自由基清除率计算公式[20]如下。
1.3.4.3 超氧阴离子自由基清除能力测定
在5支试管中分别加入2.5 mL不同浓度多糖样品溶液，再加入5.7 mL的100 mmol/L Tris-HCl缓冲液（pH8.2）[21]，置于25℃水浴锅中恒温水浴10 min。然后加入25℃预热好的6 mmol/L邻苯三酚溶液0.1 mL，摇匀后，在320 nm处测定其反应1 min时的吸光度（A）[22-23]。再取第6支试管用0.2 mL蒸馏水代替0.2 mL样品溶液作为空白组，其余试剂不变，于320 nm处测定其反应1 min时的吸光度（A0）。超氧阴离子自由基清除计算公式如下。
1.3.4.4 羟基自由基清除能力测定
在5支试管中依次加入1.5mL的0.75mmol/L邻二氮菲试剂[24]、3 mL pH7.4的150 mmol/L磷酸缓冲液[25]、1.0 mL的0.75 mmol/L FeSO4试剂，迅速混匀，再分别加入3 mL不同浓度的多糖样品溶液，1 mL 0.01%的H2O2溶液，用蒸馏水定容至10 mL，水浴温度设置为37 ℃，加热 1 h，在 510 nm 处测定其吸光度（AX）[26]。在1支试管中不添加FeSO4试剂和H2O2溶液，其余步骤均相同，在510 nm处测定其吸光度（A1）。在另一只试管中添加H2O2溶液，不加FeSO4试剂，其余步骤均相同，在510 nm处测定其吸光度（A0）。
羟基自由基清除率计算公式如下[27]。
1.4 数据处理
试验数据使用Excel 2019软件进行处理，并采用SPSS20.0进行差异显著性分析，以P＜0.05为显著性检验标准，用Origin 2021作图。
2 结果与分析
2.1 傅里叶红外光谱扫描分析
碱溶性茯苓多糖红外光谱扫描图谱见图1。
由图1可知，3 419 cm-1处强且宽的吸收峰为O—H与C—H的伸缩振动，为糖类物质的特征吸收峰；在2890cm-1处为C—H的伸缩振动吸收峰、1640cm-1处为CO的伸缩振动吸收峰；在1 372 cm-1处为C（CH3）2面内弯曲振动吸收峰、1 162 cm-1处为C—O面内弯曲振动吸收峰；1 078 cm-1和1 039 cm-1处均为C—O—C的伸缩振动吸收峰；890 cm-1处的吸收峰为C—H面外弯曲振动。由此表明提取得到的碱溶性茯苓多糖样品是β型多糖。
2.2 紫外可见分光光谱扫描分析
碱溶性茯苓多糖紫外可见吸收光谱见图2。
由图2可知，提取的碱溶性茯苓多糖在波长约230 nm处有典型的糖类物质特征吸收峰，且仅有一个特征吸收峰，而研究表明核酸和蛋白质的紫外吸收图谱中均无此特征吸收峰[28]，进一步说明此多糖为均一组分。
2.3 还原能力测定
试验以VC作为参照，采用铁氰化钾还原法考察碱溶性茯苓多糖的还原能力，结果见图3。
由图3可知，碱溶性茯苓多糖和VC的还原能力均随着浓度的增加逐步增大。浓度为0.2 g/L～0.4 g/L时，VC的还原能力高于碱溶性茯苓多糖，当浓度到达一定值（0.6 g/L）后，VC的还原能力低于碱溶性茯苓多糖。当浓度为1.0 g/L时，碱溶性茯苓多糖达到本试验所设浓度梯度范围内的最大还原能力。
2.4 DPPH自由基清除能力
碱溶性茯苓多糖及VC的DPPH自由基清除能力见图4。
由图4可知，碱溶性茯苓多糖的DPPH自由基清除率高于VC。浓度为0.2 g/L～0.8 g/L时，DPPH自由基清除率随浓度增加而升高，浓度为0.8 g/L～1.0 g/L时DPPH自由基清除率随浓度增加缓慢下降。当浓度为0.8 g/L时，碱溶性茯苓多糖的DPPH自由基清除率最大，为61.21%，说明碱溶性茯苓多糖有较好的DPPH自由基清除能力。
2.5 超氧阴离子自由基清除能力
碱溶性茯苓多糖及VC的超氧阴离子自由基清除能力见图5。
由图5可知，碱溶性茯苓多糖清除超氧阴离子自由基的能力随浓度增大呈上升趋势，张培等[29]的研究也发现茯苓多糖的超氧阴离子自由基清除率与其浓度呈正相关。在所选试验浓度范围内，碱溶性茯苓多糖超氧阴离子自由基清除率随浓度增加快速升高，但均低于VC，在浓度为1.0 g/L时，超氧阴离子自由基清除率达到最大值，为63.27%。
2.6 羟基自由基清除能力
碱溶性茯苓多糖及VC对羟基自由基的清除能力见图6。
由图6可知，碱溶性茯苓多糖的羟基自由基清除率随着浓度的增加逐渐上升，但增长较缓慢。碱溶性茯苓多糖的羟基自由基清除率略低于VC。在浓度为1.0 g/L时，碱溶性茯苓多糖的羟基自由基清除率达到最大值，为62.32%，可见碱溶性茯苓多糖对羟基自由基有较好的清除能力。
3 结论
本试验采用碱法提取九资河茯苓多糖，得到的碱溶性茯苓多糖为β型多糖。通过测定其还原能力和对3种不同体系自由基的清除率，研究了碱溶性茯苓多糖的体外抗氧化活性。试验结果表明，九资河碱溶性茯苓多糖抗氧化能力较强，且在考察浓度范围内，随着碱溶性茯苓多糖的浓度增加，其还原能力逐步增强。虽然在超氧阴离子自由基和羟基自由基清除能力试验中，碱溶性茯苓多糖的超氧阴离子自由基和羟基自由基清除率均略低于VC，但仍具有一定的自由基清除能力。本试验为九资河碱溶性茯苓多糖的提取和应用提供了新思路，为九资河茯苓的深加工提供参考。
