水稻花药培养技术的研究进展

王 敏，段海燕，姜恭好，李忠梅

（1黑龙江大学现代农业与生态环境学院，哈尔滨 150080；2黑龙江大学生命科学学院，哈尔滨 150080；3哈尔滨市益农种业有限公司，哈尔滨 150080）

0 引言

水稻(Oryza sativa L.)是世界上重要的粮食之一，因此水稻的育种是一项极其重要的任务。随着杂交水稻的出现，当前水稻的产量基本满足人们的温饱需求，但在水稻品质追求上，人们还在不断发掘与改良优越的新品种。水稻花药培养技术是一种有效、快速的育种手段，本研究对现阶段影响水稻花药培养技术的各因素、存在的问题以及对未来的发展方向进行综述和探究，为花药培养实践提供理论参考。

1 水稻花药培养技术概况

实现植株的纯合性和均一性一直是育种者的目标[1]，水稻花药培养技术的出现为实现这一目标开辟了捷径。水稻花药培养技术在中国育种历史进程中有着悠久的历史，1975年中国利用花药培养育种技术第1次育成了粳稻品种‘单丰1号’，标志花药培养技术在中国常规水稻育种中开始应用[2]，到现阶段已经发展成一种比较成熟、能快速恢复水稻固定育种系的重要生物技术工具[3]。相比于传统的育种手法，它的最大特点就是能在较短时间内获得目的基因型的水稻品种。目前水稻花药培养多采用先诱导出愈伤组织，再分化成苗两部分，在这个过程中提高出愈率和分化率是保证，一般来说经花药培养出来的幼苗是单倍体，需进行染色体加倍方可长成正常的植株，所以染色体能否加倍也是关键。中国已经通过花药培养的方法培育出了多个优质的水稻品种，并且到现阶段，已经逐渐结合其他选育手段来进行花药培养选种。如综合农艺性状好，有香味，米质达部标优质米三级标准的‘润香玉’[4]，它是以高档优质籼稻‘鄂中5号’和‘玉针香’为亲本，采用花药培养和分子标记辅助选择相结合的方法培育出的长粒型优质籼稻新品种，未来还会与其他育种技术相结合，创造出高效、快速、准确的水稻育种体系以及创造更多的优质水稻品种。

2 影响水稻花药培养技术的因素

2.1 基因型

基因型对愈伤组织诱导频率和绿苗再生效率有显著影响[5-7]，不同基因型间诱导率及绿苗分化率差异明显[8]，一般而言，花药培养力的大小为糯稻＞粳稻＞粳籼杂交稻＞籼型杂交稻＞籼稻，相同类型的不同品种间也存在着较大差异[9]。因此，筛选出有较高的花药培养力的品种作为亲本是提高花药培养率的根本保证。如水稻‘17y155’就有着较高的愈伤诱导率和绿苗分化率，适于用作花药培养F1代的亲本[10]。

2.2 取材时间及部位

叶枕间距是影响出愈率的主效因子[11]，在选材时应尽量选取主穗，叶枕距5～7 cm，且穗部饱满，但对不同地点、不同特性的水稻材料进行综合分析发现，判断叶枕距不能成为取穗的唯一标准[12]。水稻资源品种繁多，来源不同其特性也不同，不能仅以叶枕距作为标准进行取材，而应该结合品种特性、取材地的气候条件等多方面因素来确定取材标准。以穗末两叶间的节间距离作为小孢子成熟度的外指示剂，不适用所有水稻品种[13]。因此，最有效的方式应该是用显微镜检查花粉雄核发育至单核靠边期，这时候为最适宜的取材时期，也是保证出愈率的重要基础。此外，Rownak等[14]研究结果表明，不同小穗部位的花药愈伤组织能力存在显著差异，穗基部的花药愈伤组织培养能力最高。

2.3 有机成分及配比

培养基的有机成分对花药培养的出愈率以及分化率有着重要的影响[15]，但不同的水稻类型以及品种均有最适宜的培养基。刘建新等[12]经过试验得出，‘五优稻2号’为亲本的诱导培养基配方为进口N6+凝胶3.6 g/L+蔗糖60 g/L+2,4-D 2 mg/L，最佳分化培养基配方为MS+KT 2 mg/L+IAA 1 mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂4 g/L。Aananthi等[10]比较了5个亚种籼稻品种的愈伤组织形成和再生能力，证实了添加100 mL/L椰子乳作为有机补充剂可以提高愈伤组织的反应，MS+2.5 mg/L BAP+0.5 mg/L NAA+1.0 mg/L KN作为分化培养基的效果最好。陈萍萍等[16]认为，GM8培养基对籼稻材料、偏籼型材料具有较好的花药培养效果，N6培养基对粳稻具有较好的花药培养效果。张选明等[11]认为水稻籼粳交品种最优出愈培养基为M8+8 mg/L 2,4-D+8 mg/L NAA+4 mg/L KT+2 mg/L 6-BA+30 g/L蔗糖+6 g/L琼脂；最适宜分化的培养基为MS+6-BA 4 mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂6 g/L。所以，到目前为止并没有一个万能型的培养基，只能通过借鉴同类型的品种最适情况，探索出最适宜该品种的培养基及配比。

2.4 激素及其他添加物

激素能够调节植物的生长趋向，无论是愈伤组织的诱导还是对愈伤组织的分化过程，都需要一定的激素才能刺激生长，而且添加复合激素培养基处理其愈伤组织数量和发育情况明显优于单一激素处理[16]。Rahman等[17]发现，1.0 mg/L的2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)与3.0 mg/L的NAA混合后，愈伤组织诱导率显著提高，2,4-D 1.0 mg/L与BAP 1.0 mg/L配合施用，愈伤组织发育进一步增强。Lakshmaiah等[18]通过实验得出，含10 μM BAP与10 μM IAA组合的处理适合愈伤组织诱导。李三和等[19]认为诱导培养基中加入0.05 mg/L TDZ能提高花药的出愈率。此外，一些学者还发现化学物质作为胁迫预处理因子的应用可能会对谷物和其他作物的雄激素应答产生积极影响[20]。Wan等[21]经过对顽拗性籼稻品种‘MR219’进行试验，发现木质素磺酸钙(CaLS)通过增加内源生长素合成、增强营养物质吸收和调节细胞内稳态，能成功改善‘MR219’愈伤组织的增殖和生根。Rakesh等[22-23]指出，多胺在植物的生理过程中能帮助它们分化、诱导多能性、增加细胞分裂以及分子信号传导。已有学者证实了多胺能够有效促进枸杞的愈伤组织再生率和提高成苗率[24]。所以，添加激素及外源物都能刺激愈伤组织的生长于分化，且对不同品种产生的影响也不一致。

2.5 处理温度及时间

2.5.1 预处理温度及时间 冷预处理对亲本和杂种F1花药愈伤组织的诱导至关重要[25]，冷处理能够延缓花粉或花药壁的衰老，有利于花粉细胞核启动和进一步生长发育，从而提高愈伤组织诱导率和总的绿苗率。但冷处理并不是愈极端愈好，而是有一定的温度和时间范围，并且与种质也有关系。李三和等[19,26]通过实验得出预处理温度10℃、预处理时间8天能有效改善水稻花粉的生理状态，提高出愈率，且以蔗糖为碳源的诱导培养基诱导，低温预处理8天效果较好，以麦芽糖为碳源的诱导培养基诱导则预处理10天达到最好的诱导效果。孙杰等[27]认为，水稻花药在培养前必须要经低温预处理，其最适的预处理温度为8℃；冷前处理的最佳时间为9天，经过冷前处理的愈伤组织诱导率较高[28]。综合前者研究，一般水稻在8～10℃低温处理8～10天为适宜范围。

2.5.2 培养温度及时间 愈伤组织诱导出来后需要将其分离出来，然后通过继代培养增殖，再转接至分化培养基上诱导分化。过早转接，愈伤组织太小，操作比较困难，实验后期愈伤组织生长迅速，但结构松散，会降低分化成苗的几率，培养温度过高或者过低都不利于愈伤组织生长。张选明等[11]以水稻籼粳交品种的花药为植体进行试验，认为最佳愈伤转接时间为30天；培养温度为29℃时绿苗率最高。孙杰等[27,29]认为，诱导培养最佳的培养温度为28℃，27℃为最适的分化培养温度，当花药愈伤组织长至0.2 cm时应转移至分化培养基分化[30]。花药培养的时间长短还会调节组织中铜离子和银离子间的相互作用，从而影响再生植株的绿苗率[31]。过高的分化温度容易导致白化苗的产生，所以为了提高绿苗率，必须严格把控培养的时间与温度。

2.6 加倍剂

加倍剂能抑制或破坏细胞纺锤丝和初生壁的形成而产生染色体加倍，除了有的愈伤组织在继代培养的过程中已经进行了染色体加倍，一般通过花药培养产生的幼芽为单倍体，需要通过加倍剂使其变成双倍体才能正常生长。秋水仙素是最早被利用的加倍剂[32]，但由于其本身含有剧毒性，对人体以及植株都有一定影响[33]，且通过秋水仙素处理由于细胞发育的不同步性容易形成嵌合体，再生植株异常生长等缺点，有学者发现了其他可替代物，如除草剂氨氟乐灵(Pronamide)、氨磺乐灵(Oryzalin)、甲酰胺草磷(APM)和氟乐灵(Trifluralin)，对一些植物进行染色体加倍的效果比秋水仙素好，且毒害程度比秋水仙素低。但在水稻花药培养应用上，Hooghvorst等[34]通过对3种抗线粒体化合物（秋水仙碱、Trifluralin和Oryzalin）的染色体加倍能力比较，发现浓度在500 mg/L和625 mg/L的秋水仙碱不加DMSO时抗线粒体效果最好，同时也证实了秋水仙素是水稻染色体最有效的加倍剂[35]。Trifluralin和Oryzalin属于硝基苯胺类除草剂，而Pronamide属于苯基酰胺类除草剂，APM属于磷酰胺类除草剂[36]，Pronamide和APM的作用机理与硝基苯胺类略有不同，染色体加倍效果也不一样，但在水稻上应用的相关报道甚少。虽然现在已有多种方式能促使染色体加倍，如高温胁迫、γ射线处理等，但添加加倍剂却是最方便、最有效的手段，因此在加倍剂种类的开发上仍然有较大的发展空间。

3 水稻花药培养存在的问题

3.1 基因型影响大

基因型很大程度决定了花药培养力的大小，且在众多类型水稻中籼稻的花药培养力最低，因此，可以通过选择花药培养力高的品种作为亲本，或以粳籼杂交的方式，选粳稻亲缘相对较多的杂交后代进行花药培养，以提高花药培养的出愈率。

3.2 花药褐化

褐化现象是由于培养材料的组织中多酚氧化物被激活，酚类化合物被氧化形成褐色的醌类物质，醌类化合物在酶的作用下，与培养材料组织中的蛋白质发生聚合，引起其他酶失活最终导致生长受阻[37]。花药过老或者过嫩都容易褐化，因此，应严格筛选材料，选择单核靠边期的花粉是关键，还应注意给予适宜的光照强度、光照时间和培养温度。

3.3 愈伤组织褐化

据研究发现，培养基中过高浓度的无机盐和糖都容易导致愈伤组织发生褐化，所以，培养基应该控制好无机盐与糖的浓度，以及提供适宜的培养环境。还可以尝试在培养基中加入适量防褐剂如PVP、活性炭、Na2S2O3、维生素C等来抑制褐化现象[38]。从分子角度来看，Zhang等[39]发现，在BOC1基因启动子中插入转座子，编码一个SIMILAR to RADICAL诱导的细胞DEATH ONE蛋白，可以通过释放氧化应激，上调其表达，降低水稻愈伤组织褐变。

3.4 白化苗率高

植物白化是由多种基因座控制的隐性性状[40]，一定程度上与基因突变或者基因表达异常有关，基因与环境相互作用导致植株缺少合成叶绿素的叶绿体。在诱导培养基中，适当降低培养基中无机盐浓度和锰的含量，适量调整2,4-D或者KT的激素配比[41]，在不影响正常生长和分化的前提下降低温度，减少光照可以一定程度上降低白化苗率。但叶绿体受核基因与叶绿体基因双重控制，还需要从多重角度加以研究，目前仍是一个亟待解决的问题。

4 展望

双单倍体技术是作物新品种加速生产的重要手段[42]，是产生跨季节、环境和世代稳定的完全纯合系的重要工具[43-44]。且利用双单倍体技术显著减少了在育种中选择目标基因型所需的群体大小，结合分子标记辅助选择提高了选择目标基因的效率和精确度[45-46]，因此也节约了大量研究成本[47]。虽然单倍体的产生还有其他途径，且文钦等[48]最新发现OsMATL基因的突变可以诱导水稻单倍体的产生，但比起花药培养技术，后者更加简单有效。目前基因型仍是制约花药培养效率的主要原因，筛选出花药培养力高的品种作为亲本，以及将粳籼杂交来提高籼稻的花药培养力已经是中国的育种目标之一。利用标记来辅助选择促进花药培养过程中效应的主效基因，是一个高效的筛选方式，但是由于受水稻的品种、环境等影响大，影响基因的位点也不一样，筛选的难度较大。

随着科学技术水平的提高，水稻育种技术逐渐由单一的育种技术过渡到不同技术的相互交融、共同作用[49]。在未来，除了选择高效的品种作为亲本，还应注重培养体系的优化，实现花药培养实验的简单化与统一化。运用其他育种技术加以辅助，如转基因技术，通过将促进效应的基因导入到主体中从而实现高效的花药培养。此外，花粉小孢子离体培养技术在其他作物上也已是较为成熟的一种方式，可以使花粉不受花粉壁的束缚直接与培养基接触，大大提高培养速度，将其运用到水稻花药育种上，理论上比传统的花药培养技术更有优势。再者，开发一些尚未运用到水稻的高效、绿色加倍剂，是实现双单倍体、提高花药培养力的另一目标。通过现代科学手段建立起完整的水稻花药培养体系，如采用图像处理和人工神经网络相结合的方法进行建模[50]，将水稻花药培养技术运用到水稻育种上，能开发更多品质优良的水稻新品种，对丰富中国的种质资源有着重要的意义。