华支睾吸虫诊断方法概述

孙兴忠，曹利利，宫鹏涛，董 航，郭衍冰，姚新华，苑淑贤*

1.吉林省畜牧兽医科学研究院，吉林长春 130062；2. 吉林大学动物医学学院，吉林长春 130062

1 前言

华支睾吸虫病，现又名肝吸虫病，主要因华支睾吸虫寄生在人或动物肝胆管后，引发肝胆管病变的一种人畜共患病。该病流行情况比较广泛，主要在中国、日本、越南等国均有发生，我国境内多数省都有过对该病的报道[1]。人和动物感染该病主要以生食鱼、虾或饮用感染后的水源而患病，患病后初期症状不明显，会成为长期虫体携带者，慢慢会对肝胆等器官造成一定损伤，最终导致胆管发炎、肝硬化、肝胆管癌等症。因此，如何在该病的前期有效地诊断很有必要，华支睾吸虫病的诊断介绍如下。

2 诊断方法

2.1 病原学诊断

感染华支睾吸虫病的动物，其虫体会进入动物的体内，而后虫卵和幼虫会慢慢随着动物的粪便排出，这样我们就可以通过检查动物的粪便来确定感染华支睾吸虫情况，并且可确定感染严重程度。检测粪便中虫卵最好的方法主要有醛醚法、改良加藤法、沉淀法、漂浮法，氢氧化钠消化法等，并通过显微镜观察，看虫卵形态特性最终确诊是否感染，这几种方法是华支睾吸虫检测最直接有效的方法。除粪便检查外，还有十二指肠引流法可检测华支睾吸虫虫卵，此方法检出率将近100%，但实际操作技术复杂，很难实施[2]。

因华支睾吸虫虫卵比较小，鉴别该虫卵还需要有经验的专业实验员才可分辨，而且粪便检查时所需要的粪量很少，如动物感染较轻，随粪便排出的虫卵数少，这样在实际检测当中，极易造成有虫卵存在而漏检。除此之外，该虫卵与其他吸虫的虫卵在大小和形态方面有相似之处，很容易发生误诊。传统的这些病原诊断方法不但对操作人员技术要求高，而且操作过程工作量比较大，极易造成误诊、漏检等现象，很难满足大规模流调、诊断、防治等工作，实际工作中存在局限和弊端。

2.2 免疫学诊断

利用免疫学诊断华支睾吸虫病有间接血凝试验、免疫荧光抗体技术、血清循环抗原检测、皮内试验、酶联免疫吸附试验以及免疫胶体金技术等。这些方法当中，在诊断中用的较多的主要是酶联免疫吸附试验和免疫胶体金技术。病原学方法有一定的缺陷，而免疫学方法是对其的一个重要补充。随着免疫学诊断的发展，其抗原敏感性和特异性仍不能达到很高的水平，现阶段临床上在辅助诊断上应用较多，因此在流行病学调查和诊断方面是不可缺少的。随着免疫学的进步和完善，探索特异性强、敏感性好的抗原是该病诊断发展最直接的途径，并将成为免疫学诊断研究的重点[3]。

2.2.1 酶联免疫吸附试验（ELISA）

ELISA方法的出现大概在70年代之后，经过几十年的进步和完善，现在已成为成熟的免疫诊断技术，敏感性一般83.1%～100%[2]。该方法优点在于所用血量少、操作简单，实际应用便捷[4]，但有时候ELISA方法也会出现假阳性、交叉反应，现阶段在ELISA的基础上，又研究出多种改进ELISA方法。

2.2.2 间接血凝试验

间接血凝试验（IHA），该方法在一般情况下，主要使用成虫可溶解的抗原来作为检测用抗原，如将抗原进行一定程度纯化后可增强准确性。该方法拥有操作便利、速度较快，并且结果直接观察方便等诸多优点，而且感染强弱还可通过结果显现出来。但该方法多次试验证实稳定性不高，曾与粪检法比较符合率75%～95%，存在较大的差异，所以使用该方法时需注意加强重复。

2.2.3 免疫胶体金技术

胶体金主要是疏水胶体溶液,并带有负电荷。它的作用是吸附并结合像蛋白质这样的高分子物质，最后获得胶体金蛋白。因为金颗粒拥有高电子密度性质，而且标记物在固相载体上面，载体上的抗原、抗体发生反应位置的标记物汇集密度增加到一定时,我们就会看见粉红色的斑点。该方法具有敏感、简单以及快速等优点，已大规模进行检测试剂盒的研发。

2.3 分子生物学诊断方法

近几年，分子生物学迅猛进步，已大量用在多种寄生虫病诊断之中，对该病的诊断和应用有很多报道。Traub等利用核糖体的ITS序列建立PCR方法，经试验特异性71.0%，敏感性76.7%，并将该技术第一次应用华支睾吸虫病。郑培明等[5]应用实时定量PCR方法检测感染华支睾吸虫病的病人，最后证实该方法可用于该病感染检测。虽然分子生物学技术在华支睾吸虫病诊断中特异性和敏感性较高，但在实际操作中所用时间长、检测环境要求高以及需专门检测设备，所以在一定程度上限制该方法的普及应用。

2.3.1 常规PCR方法

该方法在华支睾吸虫病诊断中有着极其重要作用，它具有敏感性高、批量检测数目较大、诊断误差较小等诸多优点。Muller B等利用ITS2序列设计引物，然后建立常规PCR方法，并利用该方法从感染的淡水鱼、淡水螺中检测到了华支睾吸虫基因，检测可达10-4ng DNA ,特异性较强；而后利用PCR技术成功在粪便中检出后睾科吸虫卵，敏感性和特异性很好，该方法可用在患病动物粪便检测。现阶段，随着PCR技术的发展，该方法在临床中应用较广泛,大多应用在流行病学调查、疫病治疗期间的监测以及特异性诊断等方面发挥不可替代的作用。

2.3.2 套氏PCR方法

该方法是一种特殊的PCR方法，在操作中主要是利用2对引物，来扩增DNA，其中的两个引物分别叫外引物和内引物，外引物含有内引物的一些片段，通过2次PCR扩增2次识别靶基因，从而增加了检测敏感性和特异性。陈莹等[6]先设计PCR引物，对华支睾吸虫囊蚴的DNA扩增，将200～1 000 bp扩增片段测序后，进行同源性对比，而后根据结果设计2对引物，同时进行一次法PCR和套氏PCR，最终结果显示套氏PCR要比一次法PCR更高的敏感性，检测浓度达到10～5 ng，而且与卫氏并殖吸虫、扇棘单睾吸虫、曼氏血吸虫和麝猫后睾吸虫没有交叉反应。

2.3.3 实时定量PCR方法

相对于常规PCR方法，实时定量PCR方法不仅实现定性而且还可以定量，既可实现核酸的扩增又可对核酸进行定量。精准测出样品中DNA或RNA的准确基因数目[6]。Cai等根据华支睾吸虫ITS1核酸片段合成157 bp大小的引物，构建实时定量PCR方法。KIM等利用华支睾吸虫ITS2片段，使用该方式检测170份粪便，结果显示特异性好，只有与麝猫后睾吸虫有交叉出现。蒋智华等[7]利用线粒体中的色素C相关基因设计因引物，最终成功建立双重PCR方法，可用于鉴别华支睾吸虫和扇棘单睾吸虫。该方法对华支睾吸虫的检测逐渐完善，是分子生物学检测发展的飞跃。

3 结语

据了解，现阶段我国已大部分地区动物有华支睾吸虫病的流行，所以建立有效、快速的诊断方法迫在眉睫。而且在该病现有的诊断方法中有很多缺陷，比如假阳性、假阴性以及检测过程中交叉反应现象时有发生，这些问题都将限制检测方法的发展，所以寻求敏感特异的方法，和制备一些稳定可靠的抗原也是解决该问题的重要环节。

在现有的各种方法中，每一种方法都有其优点和不足，这就要求我们在使用时取其优点克服不足。粪便法可对该病进行确诊，但在实际检测中误检、漏检较高以及工作量相对较大。免疫学诊断方法具有方便、快捷等优点，但有时会出现假阳性，还有特异性和敏感性需要获得新的华支睾吸虫特异抗原。分子生物学的应用与发展大大提升检测的敏感性，不但可定性还可定量，这将会成为将来该病诊断方法之一，也将为今后华支睾吸虫病诊断研究起到促进作用。