活细胞内邻近标记技术的研究进展

葛阳阳，丁 明

（中国药科大学，江苏 南京 210009）

蛋白质通常形成复合物并产生对细胞结构和功能完整性至关重要的相互作用网络，无论是细胞生长、运动、细胞信号传导还是新陈代谢，蛋白质相互作用网络在细胞机制的各个层面都发挥着至关重要的作用。生物功能的执行和人类疾病的进展都与蛋白质相互作用（Protein-Protein Interactions，PPI）密切相关。而蛋白质相互作用的失调与多种人类疾病有关，包括癌症、免疫疾病和神经退行性疾病。全面了解蛋白质相互作用可为治疗肿瘤提供理论依据。蛋白质相互作用是一种动态的调控，会受到多种因素的影响，如细胞周期的改变、翻译后修饰、蛋白质构象的改变等，具有瞬时及弱相互作用的特点。这些特点对研究蛋白质相互作用造成了重大挑战。

传统研究蛋白质相互作用的方法是亲和纯化和酵母双杂交[1-2]，但是这2种方式适合研究稳定的蛋白质相互作用，比如亲和纯化会在细胞裂解和随后的洗涤步骤中导致弱或短暂的相互作用通常会丢失，然而酵母双杂交不适合研究膜蛋白，并且存在着高假阳性结果。接近标记技术（Proximity Labeling，PL）是为弥补这些传统方法在研究蛋白质相互作用的缺陷上开发出来。邻近标记技术是使用工程酶，例如工程抗坏血酸过氧化物酶或生物素连接酶，在感兴趣的蛋白（诱饵蛋白）上融合这些工程酶，酶将惰性小分子底物转化为短寿命的活性物质，从酶活性位点扩散出来以共价标记相邻的内源蛋白，从而研究蛋白质相互作用。本文将介绍目前邻近标记技术在蛋白质相互作用中的研究进展。

1 邻近标记技术分类

1.1 BioID

BioID是在2012年发现并推出，该方法利用BirA生物素连接酶的天然能力对蛋白质进行生物素化[3]。大肠杆菌中提取到这个酶，发现该酶在ATP和生物素存在的情况下，会产生活性物质biotin-AMP，然后活性物质会转移到邻近靶蛋白的表面的伯胺赖氨酸上。为了更广泛地标记附近的蛋白质，第一代BioID使用BirA*（R118G）。与BirA相比，BirA*对biotin-AMP的亲和力较低，这可以在10 nm半径内释放更多的活性物质，更好地对周围蛋白质进行生物素化[4]。BioID需要相对较长的标记时间，以清楚地标记相互作用的蛋白。在2016年，KIM等[5]提出了基于Aquifex aeolicus发现的BioID2（R40G），它缺少了DNA结合区域，因此分子量要比BioID小8 kDa，从而可能最大限度地减少对诱饵蛋白的功能干扰。BioID2与BioID相比显示出更高的活性并且需要更少的生物素。同样，BASU是一种来自Bacillussubtilis的BirA，与BioID和BioID2相比，具有更高的生物素化活性[6]。与BioID2一样，BASU缺少N端DNA结合结构域，并且分子量比BioID小。

1.2 BioID突变体

研究者为进一步提高BioID酶的活性，通过使用基于酵母展示的定向进化，设计了2种增强的BioID变体：35 kDa TurboID和28 kDa miniTurbo[7]。最后，这些变体显示出显著的标记能力，将标记时间从16～18 h缩短到10 min，其大小和特异性与BioID相似。此外，与BioID和BioID2蛋白相比，TurboID和miniTurbo的邻近标记活性在不同的pH范围和低温下是稳定的[7]。有趣的是，研究者将BioA*酶分为2个片段而开发出Split-BioID方法。Split-BioID可以用于研究二聚化依赖性蛋白质相互作用，将BirA*分为2个片段，分别连接到2个相互作用的蛋白上，在2个相互作用的蛋白靠近形成蛋白质复合体时，BirA*重新组装恢复活性从而生物素化底物和其他邻近蛋白质[8]。

1.3 APEX

2013年开发出APEX方法，该方法基于与BioID相同的原理[9]。它使用一种与BioA*不同的酶——单体抗坏血酸过氧化物酶，对诱饵蛋白质附近的蛋白质进行生物素化。原理是在过氧化氢存在下，该酶将生物素-苯酚氧化为生物素苯氧基，这是一种半衰期短的自由基，会与富含电子的氨基酸（如酪氨酸、色氨酸、组氨酸和半胱氨酸）发生共价反应，在诱饵蛋白质周围约20 nm的半径内标记蛋白，标记反应可以通过去除H2O2和添加淬灭缓冲液来停止，随后可以使用链霉亲和素珠分离得到的生物素化蛋白质，并通过MS进一步分析。APEX技术与第一代BioID技术的主要区别在于生物素化蛋白质所需的孵育时间。由于过氧化氢对细胞的毒性，随后开发了第二代APEX（A134P）以提高酶的催化效率，减少因暴露于过氧化氢而引起的细胞应激反应，并允许对感兴趣的蛋白质的较低表达水平进行研究[10]。与BioID技术相比，APEX酶活性更高，所标记的蛋白数量更多，但是暴露于过氧化氢还可以通过激活信号通路以响应氧化应激、细胞器动力学或整个蛋白质相互作用来改变细胞的生理机能，出现假阳性的结果。与BioID相同，APEX技术也扩展到利用互补进行邻近标记的Split-APEX技术，原理与Split-BioID相同。

1.4 PUP-IT技术

除了上述3中邻近标记技术以外，研究者还开发了一种使用细菌Paf A酶的新邻近标记技术——PUP-IT[11]。与使用BioID和APEX不同，PUP-IT使用称为Pup的小蛋白质标记蛋白质。将PafA与诱饵蛋白融合，随后会将Pup连接到附近的任何赖氨酸残基上，从而发现目标蛋白，使其成为一种潜在有用的邻近标记酶。

2 邻近标记的应用

2.1 蛋白质相互作用网络

近年来，邻近标记技术已经越来越多地被应用于蛋白质相互作用网络的研究。BioID最初是为研究哺乳动物细胞中的体内核lamin-A而开发的[3]。现如今BioID已成功应用于多种细胞内环境。在哺乳动物细胞中，BioID被应用于探测不同亚细胞结构的蛋白质相互作用网络，例如核孔复合物、线粒体和中心体-纤毛界面等。CHOU等[12]使用BioID来识别TDP43聚集体的相互作用物，TDP43聚集体是神经退行性疾病的常见组织病理学标志物，包括肌萎缩侧索硬化和额颞叶痴呆。通过将BioID与TDP43融合以进行邻近标记技术，研究者确定了核质转运机制。后续研究还表明，TDP43聚集体破坏核孔蛋白和转运因子功能。蛋白质相互作用在细胞信号转导通路中发挥着重要作用，但其中上游和下游蛋白或小分子仅与感兴趣的蛋白质之间是短暂相互作用，对研究信号通路造成了重大挑战。COUZENS等[13]使用BioID探测Hippo通路中的相互作用物，Hippo信号通路控制细胞增殖和凋亡以决定器官大小。通过使用BioID绘制19种途径蛋白的相互作用组，研究者为Hippo途径生成了蛋白质相互作用网络，并确定了许多推定的调节剂和激酶底物。后续不同的研究者通过邻近标记技术绘制了不同信号通路的蛋白质相互作用网络，比如 NF-κB[14]、Ras[15]、MAPK[16]等。APEX技术1 min的标记时间框架可以被利用来捕捉动态细胞过程中所涉及的蛋白质相互作用组变化。PAEK等[17]用APEX技术探究激活剂激活后血管紧张素II 1型受体（AT1R）和β2-肾上腺素能受体（β2AR）的信号传导过程，APEX还被用于探究激动剂治疗后δ-阿片受体相互作用组的变化。

2.2 蛋白质与DNA相互作用

蛋白质与DNA相互作用对于基因表达、基因组完整性和染色质组织的调节至关重要。ChIP-seq被广泛用于捕获和测序与诱饵蛋白质相关的DNA区域。这种邻近标记技术适合运用在活细胞中，并使用过氧化物酶APEX对靠近诱饵的蛋白质进行生物素化，这些蛋白质又通过甲醛交联到相邻的DNA区域。随后，生物素化的蛋白质-DNA片段复合物通过链霉亲和素进行富集，并通过下一代测序进行分析。最近，ChromID被用于研究特定染色质标记处的蛋白质相互作用组，该方法鉴定了在组蛋白H3 Lys4和Lys27[18]上三甲基化修饰的启动子区域。尽管酶的存在可能会影响与染色质结合的相互作用蛋白，但这些研究提供了一种工具来研究染色质功能的调节机制。基于APEX的邻近标记技术也被用于绘制与线粒体DNA相关的蛋白质图谱，揭示了7种以前未知的线粒体类核相关蛋白[13]。

2.3 蛋白质与RNA相互作用

蛋白质和RNA之间的相互作用对于广泛的细胞功能也是至关重要，目前邻近标记技术已与蛋白质-RNA交联相结合，以在特定亚细胞区域发现接近诱饵蛋白质的RNA。APEX-RIP[19]使用甲醛，在细胞裂解前将APEX生物素化蛋白质与RNA交联，从而实现基于链霉亲和素的蛋白质-RNA复合物富集。APEX-RIP和Proximity-CLIP已应用于研究内质网膜、核纤层和细胞表面[20]的RNA。FAZAL等[21]使用APEX-seq生成转录组范围的人类成纤维细胞亚细胞RNA图谱，发现了转录本位置与基因组结构和蛋白质定位之间的关联。

3 总结

自从邻近标记技术问世以来，越来越多的研究者将其应用于各个领域，比如植物、斑马鱼、蠕虫等。本文介绍了目前使用的邻近标记技术及其应用，邻近标记技术的出现为蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA、蛋白质-RNA相互作用的研究提供了很大帮助，邻近标记技术有着传统方法不能相比的优势，它可以捕捉弱、瞬时的的蛋白质相互作用，可以在空间和时间上监测细胞的动态变化过程。同时各种邻近标记酶的发现与优化加速了细胞图谱的绘制进行，加速了对细胞信号通路的研究。随着邻近标记技术的蓬勃发展，将为广大的研究者提供新的思路，推动一些重要生命科学问题的解决，为发现一些疾病的发病机制提供新方法。