呼吸道病毒和细菌共感染分子机制研究进展

陈 静，李燕燕，袁 祥，叶 超，彭远义

(西南大学 动物医学学院，重庆 400715)

近年来，人们发现越来越多严重呼吸道疾病由多种细菌和病毒等致病因子共同感染所致，细菌和病毒共感染引起的呼吸系统疾病正在严重威胁人类健康和畜牧养殖业发展。临床上，呼吸道病毒和细菌混合感染常引起严重的呼吸道疾病综合征，比如人类的流感以及猪、牛和鸡等畜禽的各种呼吸道疾病综合征等，并最终导致人和动物的高死亡率。研究表明，流感病毒和呼吸道合胞体病毒等病毒感染后常伴随细菌感染，引起继发细菌性肺炎，导致感染者死亡，特别在老年人和儿童中更为显著。据统计，流感病毒感染合并继发细菌性肺炎每年可导致全球约两万人死亡[1]，对人类的生命健康构成了很大威胁。当前正在全球流行的SARS-CoV-2也引起呼吸道症状，导致肺炎、急性呼吸综合征、肾衰竭、甚至死亡，表现出较强的传染性、隐蔽性和变异性，严重影响了正常的社会秩序和全球经济发展[2-3]。近期研究表明，SARS-CoV-2感染者的咽拭子中细菌丰度显著增加，其中有51种细菌丰度增加超过8倍，而且这些细菌能够刺激SARS-CoV-2受体ACE2表达进而促进病毒感染，暗示新冠肺炎患者咽部细菌在SARS-CoV-2感染中参与了病毒和宿主的相互作用，继而调节SARS-CoV-2感染[4]。

猪呼吸道疾病综合征(PRDC)和牛呼吸道疾病综合征(BRDC)是严重危害生猪和肉牛产业的呼吸道疾病，这类疾病是由病毒、细菌、应激和免疫力低下等多因素引发。其中，PRDC是猪繁殖与呼吸综合征病毒等病毒感染后继发多杀性巴氏杆菌、支气管败血波氏杆菌、副猪嗜血杆菌和猪链球菌等细菌感染所致，表现为呼吸急促、发热、间质性肺炎等症状，病死率高，成为威胁养猪业的一大顽疾[5]；BRDC则主要由多杀性巴氏杆菌、溶血性曼氏杆菌等细菌，牛传染性鼻气管炎病毒、牛副流感病毒3型和牛呼吸道合胞体病毒等病毒混合感染引起，多种病原体通过复杂的机制共同致病，临床症状多表现为流鼻涕、咳嗽、呼吸困难等呼吸道症状，严重制约了全球养牛业的发展[6]。

由此可见，无论是人类，还是动物，都存在呼吸道细菌与病毒共感染的情况，但是以上这些致病因子是如何通过复杂的相互作用机制引起疾病的发生发展，仍然不是很清楚。现将从病原相互作用、宿主免疫调控和病理损伤机制等方面，对近年来呼吸道病毒和细菌协同感染分子机制研究进展进行综述，为病毒和细菌共感染机制研究及呼吸道感染性疾病防控提供借鉴。

1 病毒可直接或间接影响细菌黏附

1.1 病毒介导的细胞脱落可促进细菌非特异性黏附早在1949年，病理学家就注意到病毒侵入上皮细胞能够致使细胞斑块脱落并介导细菌黏附。HERS 和 PARKER在1961和1963年也分别发现，流感病毒介导的细胞脱落会暴露非常适合细菌附着的细胞基底膜组分，同时上皮再生也会产生过量透明样变化和纤维蛋白原、纤粘连蛋白以及细菌可以结合的其他基质物质，这些都能够促进细菌的黏附。在非流感病毒也发现有类似的情况，比如呼吸道合胞体病毒、人副流感病毒3型和副黏病毒，同样也会诱导类似的细胞斑块脱落模式[7]。

1.2 病毒与细菌直接相互作用促进彼此感染人呼吸道合胞体病毒和肺炎链球菌是引发儿童和老年人肺炎的主要病原。研究表明，呼吸道合胞体病毒感染时能够与肺炎链球菌发生相互作用，其通过与细菌青霉素结合蛋白1a直接相互作用并结合到肺炎链球菌的表面，从而增强细菌对上皮细胞的黏附[8]；进一步研究发现，单独的呼吸道合胞体病毒糖蛋白即可增强肺炎链球菌和流感嗜血杆菌对上皮细胞的结合与黏附[9]，表明病毒糖蛋白参与了病毒与细菌间互作并促进细菌黏附。

其他呼吸道感染病毒也能够通过直接相互作用促进相应共感染菌的黏附。猪流感病毒通过识别猪链球菌荚膜多糖中的α-2，6唾液酸促进细菌黏附和感染[10-11]。流感病毒能够与在呼吸道定殖的革兰阳性菌(如肺炎链球菌和金黄色葡萄球菌)、革兰阴性菌(如卡他莫拉菌和流感嗜血杆菌)表面直接相互作用，促进细菌在呼吸道上皮细胞的黏附[12]。类似的，多种肠道感染病毒也能够与共感染的细菌直接结合，通过细菌与细胞的黏附作用促进相应病毒感染。比如，脊髓灰质炎病毒可通过与多种细菌的膜组分如脂多糖或肽聚糖相结合，从而促进自身的感染，但是细菌与脊髓灰质炎病毒表面表位结合的具体情况还有待研究[13]。虽然病毒和细菌之间直接相互作用的机制尚未被充分认识，但是二者通过直接相互作用促进彼此感染，很可能是病毒和细菌共感染的普遍策略。

1.3 病毒通过调控细胞受体表达影响细菌黏附病毒能够通过改变某些宿主蛋白的表达，调节共感染中细菌的黏附和入侵。研究表明，呼吸道合胞体病毒、冠状病毒和流感病毒等感染后，可通过调节某些细胞受体如细胞间黏附分子-1(ICAM-1)、癌胚抗原相关细胞黏附分子、纤连蛋白和血小板激活因子受体(PAFR)等的表达(显著上调)，从而促进继发性感染细菌对呼吸道上皮细胞的黏附[14]。特别是PAFR可作为多种呼吸道细菌如肺炎链球菌、流感嗜血杆菌和铜绿假单胞菌等感染的识别分子[15-17]，因此病毒诱导的PAFR表达上调对于促进多种细菌黏附起着重要调控作用。在兽医相关病原共感染研究方面，牛呼吸道合胞体病毒感染牛原代气管、支气管和肺上皮细胞后，也能够影响共感染多杀性巴氏杆菌的黏附，表现为促进细菌在下呼吸道(支气管和肺上皮细胞)的黏附，而抑制其在上呼吸道(气管上皮细胞)的黏附[18]。进一步研究显示，牛呼吸道合胞体病毒和牛冠状病毒感染均能够使牛下呼吸道上皮细胞PAFR的表达上调，而且引起牛BRDC的细菌性病原如多杀性巴氏杆菌等对细胞的黏附也依赖于PAFR的表达[19-20]，这表明动物病毒感染也可通过改变相应动物宿主蛋白表达以促进共感染细菌的黏附。

更深入的研究发现，流感病毒的神经氨酸酶蛋白(NA)能够通过去除宿主蛋白TGF-β唾液酸基序来触发TGF-β激活，而TGF-β激活会显著增加细菌黏附细胞相关受体分子整联蛋白、纤连蛋白和整合素的表达，从而促进链球菌等细菌的黏附[21]。另外，半乳糖凝集素Gal1和Gal3均能够与流感病毒和肺炎链球菌结合，并且流感病毒感染或其编码NA蛋白处理均可增加半乳糖凝集素介导的肺炎链球菌对细胞表面的黏附。在流感病毒感染后，可通过宿主细胞表面分子与病毒NA蛋白、肺炎链球菌三者之间的相互作用，从而增强肺炎链球菌对气道上皮表面的黏附[22]。

不过，在有些情况下某些病毒感染会降低细菌对上皮细胞的黏附。比如，牛呼吸道合胞体病毒感染上呼吸道上皮细胞时，可通过下调牛气管上皮细胞(bTEC)上ICAM-1的表达，从而显著减少多杀性巴氏杆菌的黏附。在正常生理条件下，bTEC在上呼吸道能够捕获多杀性巴氏杆菌，而牛呼吸道合胞体病毒感染导致bTEC对细菌的捕获功能被破坏，这进一步促进了细菌侵入下呼吸道并导致继发性或更严重的呼吸道感染[23]。以上研究表明，病毒感染后通过调控宿主呼吸道不同部位细胞表面受体的表达，抑制或促进细菌对上、下呼吸道上皮细胞的黏附，从而增强细菌继发性感染的能力。

2 病毒通过破坏呼吸道上皮及屏障促进细菌继发感染

2.1 病毒可破坏呼吸道上皮的生理功能作为抗感染的第一道防线，呼吸道上皮具有屏障作用，能够抵挡大多数病原体感染。但是，研究发现流感病毒感染可直接导致呼吸道上皮损伤，引起肺炎球菌在鼻咽部过量累积，进而促进细菌向肺部传播[24]。而且，病毒引起的上皮细胞损伤和脱落，增加了细菌与细胞受体的结合，促进细菌定殖和疾病发生。进一步研究发现，流感病毒可通过NA蛋白剥离肺部组织上的唾液酸，从而暴露细胞上的细菌黏附受体，促进细菌增殖和加剧肺炎发展[25]。此外，流感病毒感染能导致肺部发生多种变化，包括上皮损伤、表面活性物质破坏和细胞脱落到气道，这给继发感染的细菌提供了入侵机会和丰富的营养来源，能促进细菌的快速生长。而且随着纤维蛋白质材料释放和黏蛋白的分泌，小气道开始发生堵塞，不仅减少了氧气和二氧化碳的扩散能力，使得肺功能也发生障碍，同时黏膜纤毛摆动频率下降、纤毛运动不协调，使其对细菌的清除能力下降，最终导致宿主氧交换减少、气道高反应性和细菌机械性清除减少[26]。牛呼吸道合胞体病毒感染牛也能够增加相关继发性感染细菌黏附的数量，这主要是通过破坏呼吸道上皮细胞正常运输机制，导致细菌顺利通过下呼吸道并到达肺部，引起继发性并发症和严重的肺炎[27-29]。

常年附着在呼吸道的菌群能够抵抗呼吸道致病菌的定植，在维持呼吸道生理和稳态中发挥重要作用。研究表明，呼吸道中的微生物组还可能与宿主对流感病毒易感性密切相关。例如，小鼠口服抗生素治疗后细支气管上皮层退化增强，而且鼻内感染流感病毒后死亡风险增加。类似的，人类新生儿喂养益生元和益生菌的呼吸道感染发生率会显著降低。进一步的研究显示鼻咽微生物组成差异可影响个体对流感的易感性，鼻咽中的微生物组或是未来开发有效抑制流感扩散的新型靶点[30]。

2.2 病毒感染可破坏呼吸道屏障病毒-细菌双重感染会导致上皮-内皮屏障功能障碍，从而导致体液、红细胞和白细胞渗出到肺泡空间，导致气体交换障碍和严重的肺呼吸功能不全，在临床上主要表现为严重的肺水肿和出血。目前已知，呼吸道上皮的物理屏障功能由4种类型的细胞连接提供：紧密连接、黏附连接、间隙连接以及桥粒。研究表明，流感病毒感染诱导的肺物理屏障破坏就与claudin-4(一种紧密连接蛋白)的完整性丧失有关。此外，禽流感病毒NS1蛋白的PDZ结合基序与宿主细胞紧密连接蛋白中存在的 PDZ 结构域之间可以发生相互作用，病毒通过这种互作机制也能够破坏上皮细胞连接的完整性。最新研究证明，流感病毒感染诱导宿主钙蛋白酶calpain和转录因子Snail1的激活，而这两种蛋白分别负责宿主细胞连接蛋白的降解和转录抑制；病毒感染后大大增加了细菌跨越上皮屏障的机会，为继发性细菌通过细胞旁连接处转移到更深的组织中提供了途径[31]。不过，目前涉及病毒诱导细胞上皮功能障碍促进细菌感染的分子机制研究仍然较少，还需进一步的探究。

3 病毒通过调控宿主免疫应答促进细菌感染

宿主除了依靠上皮细胞等组成的物理屏障抵御病原体感染外，还能够依赖巨噬细胞等白细胞组成的先天性免疫防线抵御感染。FISHER和WALSH等研究人员很早就注意到豚鼠和人类感染流感病毒后白细胞募集会显著减少，而后SELLERS及其同事发现流感病毒感染后淋巴细胞功能受损是细菌感染增加的原因。这些早期的研究表明，继发性细菌感染不仅是由上皮组织物理改变引起，而且还可由一个复杂的异常免疫信号级联系统引起[7]。事实上，病毒感染后先天性和适应性抗菌免疫失调确实在细菌继发感染上起着重要作用，下面将从病毒影响细胞因子、趋化因子和免疫细胞等功能方面进行概述(图1)。

图1 病毒和细菌共感染过程涉及的免疫应答机制

3.1 病毒影响免疫介质的表达

3.1.1Ⅰ型干扰素 Ⅰ型干扰素包括多种干扰素α蛋白和一种干扰素β蛋白，它们通过与Ⅰ型干扰素受体作用诱导多种抗病毒因子的表达。不过，虽然普遍认为Ⅰ型干扰素主要与先天抗病毒应答有关，但它们也可作为感染流感病毒后细菌感染的关键免疫介质发挥作用。在肺炎球菌单独感染宿主鼻咽部时，宿主通过核苷酸结合寡聚化结构域蛋白质2(NOD2)识别肺炎球菌肽聚糖，然后激活核转录因子NF-κB以促进单核细胞CCL2/CCR2(趋化因子配体2及其受体)结合，这种结合有助于抗菌单核细胞或巨噬细胞募集和分泌Ⅰ型干扰素，从而促进鼻咽部细菌的清除。而流感病毒和细菌共感染时会诱导过量的Ⅰ型干扰素产生，其通过阻断 NOD2 介导 CCL2的表达，减少单核细胞和巨噬细胞向上呼吸道的募集，从而减弱宿主的杀菌能力。有趣的是，敲除NOD2 或缺失肺炎球菌溶血素(用于NOD2 识别肺炎球菌)，可以消除过量的干扰素产生并使细菌载量返回到正常水平。这表明病毒和细菌共感染引起的Ⅰ型干扰素过量累积反而会关闭宿主抗菌免疫通路，使宿主失去了早期控制细菌增殖的机会[7]。

此外，在共感染期间过量产生的干扰素α，能够抑制肺角质形成细胞源性趋化因子(KC)和巨噬细胞炎性蛋白-2(MIP-2，有效的中性粒细胞趋化信号)的产生，而以上因子是宿主有效清除肺部细菌所必需的相关细胞因子。因此，共感染引起肺部产生过量干扰素α能够进一步加剧下呼吸道细菌性肺炎[7]。鼻咽组织和肺组织中过量Ⅰ型干扰素产生的独特效果，也表明在同一宿主内免疫过程的复杂性和组织异质性。

3.1.2Ⅱ型干扰素 Ⅱ型干扰素(γ干扰素)主要由自然杀伤细胞、CD4+T辅助细胞和CD8+细胞毒性T淋巴细胞产生。在共感染模型中，当流感病毒感染7 d后进行细菌接种，病毒诱导的吲哚胺2，3-二氧化酶(IDO)可促进IL-10表达增加，这会进一步间接导致过量γ干扰素的产生。抑制IL-10信号后，则可以显著减少γ干扰素的分泌，提高细菌的肺清除率和存活率。然而，在原发性细菌感染期间，IL-10分泌增加具有典型的抗炎作用，并抑制干扰素γ应答，对抗肺部细菌清除。值得注意的是，流感病毒感染期间Ⅰ型干扰素的分泌增加了IL-12p70的产生，其是一种γ干扰素和Th1极化的主要诱导物，因此在继发性细菌感染期间，过度γ干扰素应答也可能是过度Ⅰ型干扰素应答所致[7]。

3.1.3促炎细胞因子 在流感病毒感染期间，细胞因子IL-1信号通路的激活会加剧急性肺组织免疫病理损伤，但是它在对侵袭性肺炎球菌感染的免疫防御中能起到保护性作用，最终提高动物的存活率[32]。进一步研究表明，在没有流感病毒感染情况下，肺泡巨噬细胞能够有效清除肺炎球菌的感染。致死性流感病毒和肺炎球菌混合感染时则抑制了肺泡巨噬细胞的抗菌活性，而细胞因子IL-1信号通路通过防止肺泡巨噬细胞的耗竭，从而参与宿主对流感病毒和肺炎球菌协同感染的抵抗[33]。

在兽医临床上，猪繁殖与呼吸综合征病毒可使猪继发感染副猪嗜血杆菌，二者混合感染可促进促炎细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-8的表达[34]。另外，副猪嗜血杆菌的RNA单独能够诱导IL-1β表达和分泌，并显著增强猪繁殖与呼吸综合征病毒感染细胞IL-1β、TNF-α和IL-6等的表达[35]。这暗示在自然条件下由这两种病原体引起的呼吸系统疾病与促炎因子介导的免疫病理学结果密切相关。此外，猪圆环病毒2型在与胸膜肺炎放线杆菌共感染过程中，也可促进细菌对猪肺泡巨噬细胞的黏附和侵袭。具体来说，猪圆环病毒2型通过抑制细胞膜NADPH氧化酶活性来抑制活性氧(ROS)的产生，可提高猪肺泡巨噬细胞中细菌的存活率。在共感染期间，猪圆环病毒2型还通过降低TNF-α、IFN-γ 和IL-4的表达来减弱宿主炎症反应和巨噬细胞抗原呈递，从而降低宿主对入侵细菌的清除能力[36]。

3.2 共感染改变免疫细胞的功能

3.2.1中性粒细胞 在流感病毒感染后的肺炎球菌感染期间，中性粒细胞的作用可能是有益的，也可能是有害的。许多研究表明，在这类感染过程中，中性粒细胞募集会减少或增加。当肺炎链球菌感染发生在接种流感病毒后3 d内，中性粒细胞有助于细菌的肺部清除和存活。但是在共感染6～10 d时，则产生了过度但无效的应答，无法控制细菌感染。而这种杀菌功能的损害可能是因为IL-10分泌增加或过度趋化，招募成熟和未成熟的中性粒细胞混合到一起，而未成熟的中性粒细胞无法引发适当的抗菌防御所致[7]。此外，中性粒细胞具有一种称为胞外诱捕网的独特胞外杀菌活性结构，其通过使中性粒细胞经历一种称为NETosis的细胞死亡形式，将与颗粒蛋白结合的染色质释放到胞外形成网状结构，从而捕捉和杀死细菌。研究表明，肺炎球菌与流感病毒共感染能够促进诱捕网的形成和降解，诱捕网降解由细菌内切酶介导，使细菌能够从诱捕网缠结中释放。尽管NETosis有助于在非复杂感染期间控制细菌感染，但在病毒细菌共感染期间，它则会导致上皮和内皮损伤，从而增加肺和中耳炎症、败血症和小血管炎，最终损害肺部的肺泡毛细血管表面[7]。

3.2.2NK细胞、单核巨噬细胞和相关T细胞 过量的Ⅰ型干扰素不仅能促使机体形成抗病毒状态，而且能抑制NK细胞对细菌感染的应答和 TNF-α 等炎性因子的产生，抑制巨噬细胞和中性粒细胞正常的吞噬活性，从而削弱宿主的抗菌能力[37-38]。过量分泌Ⅰ型干扰素也可通过抑制γδ-T细胞IL-17的分泌而降低细菌清除率，因为IL-17是宿主有效清除细菌的关键因子。此外，在金黄色葡萄球菌与流感病毒共感染期间，Ⅰ型干扰素可抑制NF-κB介导的IL-1β和IL-23的产生，这2种细胞因子对T辅助型17(Th17)细胞极化至关重要；共感染还会导致IL-17、IL-22和单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)产生减少，并抑制单核细胞和巨噬细胞的募集以及对金黄色葡萄球菌的清除[7]。由于γ干扰素过量产生和相关促炎性细胞因子分泌减少，单核细胞吞噬功能显著降低，氧化自由基浓度增加，肺泡巨噬细胞中清道夫受体MARCO的表达降低，宿主有效清除下呼吸道入侵者的能力下降[39]。

3.2.3免疫细胞凋亡 尽管继发感染期间的白细胞减少可能是由于趋化因子介导的白细胞募集减少所致，但也可能是由于细胞凋亡所致。研究表明，继发感染可引起肺泡巨噬细胞显著表达半胱天冬酶-8和-3激活剂fas相关蛋白并引发细胞凋亡，这可导致90%以上的肺泡巨噬细胞在流感病毒感染后14 d 内短暂丢失。在非流感病毒感染模型中，淋巴细胞性脉络膜脑膜炎病毒与细菌共感染模型的研究结果表明，骨髓粒细胞凋亡后，中性粒细胞募集会显著减少，致使许多种类细菌的继发性感染增加[7]。

4 共感染细菌对病毒感染的调节

尽管上述讨论的大多数机制涉及的是病毒促进随后的细菌超感染，但是共感染细菌也能通过相关机制影响病毒感染。细菌对病毒感染的调节方式主要包括二者直接相互作用、细菌干扰抗病毒免疫和通过与病毒具有类似功能的毒力因子协同或互补来介导调节。动物模型显示，在病毒感染后由细菌激发的细菌超感染期间，流感病毒感染滴度会明显增加。然而，如果细菌先于病毒感染，其可通过自身毒力因子诱导抗病毒先天免疫反应，病毒感染则会被抑制，动物发病率则会降低[26]。目前，细菌通过毒力因子干扰抗病毒免疫仍是一个很少被探索的领域，相关研究数据支撑较少，但是鉴于细菌具有广泛干扰先天免疫的机制，其很可能在共感染期间影响宿主对病毒的免疫应答。还有证据表明，微生物组可通过改变宿主抗病毒应答的激活阈值和影响适应性免疫的发展，进而改变宿主对流感的免疫反应[40-41]。肺炎链球菌和金黄色葡萄球菌等病原体在定殖期间是否具有相似的作用是一个值得探索的有趣领域。另外，有些病毒和细菌的相关基因产物(例如，病毒性和细菌性神经酰胺酶和细胞毒素等)具有相似的功能。在共感染期间，二者在相关基因的功能方面可能会相互协同或互补，以促进细菌生长或病毒复制、避免宿主免疫监视或引起宿主的炎症和损伤等[42-43]。

5 展望

当前，人类各种呼吸道疾病特别是大多数肺炎多为细菌和病毒共感染所致，动物呼吸道病毒与细菌共感染的现象也越来越普遍，人们对共感染机制的研究也在不断加强。但是共感染往往涉及到多种病原体、宿主免疫系统和微生物组之间复杂的相互作用，这不仅打破了长期以来被广泛接受的一个病原体对应一种疾病的科赫法则，也对现有的研究手段和方法提出了挑战。同时在动物病毒与细菌共感染疾病中，单一病原体的动物实验难以重现临床上的疾病表征，导致这类疾病的主要病原体仍难以鉴定，它们之间在感染致病中的相互作用机制仍需要进一步研究。

在以后的研究中，在研究手段方面，可运用激光共聚焦技术、电镜技术、多组学测序技术等技术手段，以及建立呼吸道上皮细胞气液界面培养、离体组织培养等培养平台开展多种病原体共感染分子机制研究；在研究内容方面，可侧重病毒与细菌的互作机制、病毒(细菌)对宿主屏障结构、抗感染免疫应答机制的影响以及宿主反应对细菌(病毒)感染机制的影响等，以阐释不同病原体进行协同感染的不同分子机制，逐步揭开多种病原体共同感染导致呼吸道感染疾病发生机制的神秘面纱。

通过研究病毒与细菌共感染的机制，将有助于鉴定引起各类畜禽呼吸道疾病的主要病原体，阐明多种病原体导致严重呼吸道疾病的分子机制，为更好防控该类疾病奠定重要的理论基础。更重要的是，除了研究了解呼吸道病原体共感染的生物学基础外，通过对该领域的重点研究可为避免下一场类似新冠肺炎疫情的大流行做好积极准备和应对策略。