葛根素对牙周炎大鼠Th17/Treg 细胞免疫平衡及相关转录因子表达的影响

詹乐，马瑞堉，万妮，莫礼文，陈荟颖，张黎

（1）海南医学院口腔医学院，海南 海口 570102;2）兰州大学口腔医学院，甘肃 兰州 730000）

牙周炎已发展成为人类最普遍的慢性感染性的口腔疾病之一[1]。相关调查与研究表明，成人牙周炎发病率约达70%，一旦治疗不及时，会引起牙槽骨不可逆性损伤，最后导致牙齿松动，这也是成年人失牙的最主要原因[2]。牙周病的病因很复杂，其具体的发生机制目前还不清楚。

目前研究指出，在牙周病的病理破坏过程中，牙周病的始动因子为牙菌斑生物膜，宿主免疫的过度炎症反应通常是加重牙周软硬组织破坏的主要损害因素[3]。有关学者提出有关于调控宿主防御反应方法，被称为宿主免疫调节治疗（host modulatory therapies，HMT），通过研究抑制牙周组织的不可逆性的损伤破坏[4]。在常规牙周防治手段的基础上，辅助应用宿主免疫调节药物以达到理想的防治效果。其中主要以六位地黄丸为研究基础的固齿膏及固齿丸等[5-6]。近年研究表明，一些植物中药提取物常常可以辅助治疗牙周病，例如：姜黄素、白藜芦醇等。葛根素（Puerarin）属于异黄酮类，也是防治牙周病的有效成分。有相关动物实验研究初步证实，葛根素具有抗炎、抑制相关基质金属蛋白酶（matrixmetalloproteinase，MMPs）、骨保护等生物活性功能，同时有较高的相关生物的安全性，是对牙周炎宿主调节治疗的最有效药剂之一[7]。Wang等[8]研究表明辅助性 T细胞17（Th17）、调节性 T 细胞（Treg）之间比值失衡所导致的自身免疫反应，会引起牙周组织病理发病机制。目前，在牙周病的发展过程中，葛根素药物通过调节Th17/Treg 细胞免疫平衡，以减少牙周组织病理性破坏的主要机制还需要进一步证实。本实验采用牙周炎大鼠，并给予200 mg/（kg·d）葛根素液灌胃处理，以进一步去观察葛根素液对牙周炎大鼠Th17/Treg 细胞免疫状态平衡的影响，为开发慢性牙周炎药物提供新的分子靶点，同时为治疗慢性牙周炎提供新的方法和理论依据，揭示葛根素老药新用的临床转化价值。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物上海斯莱克实验室提供实验动物，SPF 级Sprague-Dawley（SD）大鼠，8 周龄，雄性，体重（260 ± 20）g，许可证号：SCXK（苏）2019-0005，实验动物房，许可证号：SYXK（浙）2020-0015 。本研究经浙江杭州赫贝科技有限公司实验动物伦理委员会审批（审批号：HB2010037）。

1.1.2 主要试剂及仪器葛根素注射液（国药准字H20033292，规格 2 mL∶100 mg，生产批号：20 060 472）山东华信制药集团股份有限公司；PE anti-rat CD25 Antibody、Foxp3 Antibody、IL-17A Monoclonal Antibody、PE-Cyanine7、Fixation/Permeabilization 和 Permeabili-zation Buffer（eBioscience，USA）；其他试剂均为国产分析纯。MicroCT设备（瑞 士 SCANCO Medical AG，µCT100）。微量加样仪（Thermo 公司）；高速冷冻离心泵（H1650R，上海卢湘仪）；流式细胞仪（Accuri C6，BD 公司）。

1.2 方法

1.2.1 牙周炎大鼠建模、实验分组Sprague-Dawley（SD）大鼠36只，SPF级，雄性，8 周龄，体重为（260 ± 20）g，无牙周疾病，健康状况良好。试验前在动物实验房环境中适应1 周。聚丙烯的合成塑料大鼠小笼分笼饲养，温度（24 ± 2）℃，相对湿度为40%～60%，明暗周期12 h/12 h。自由饮水、饮食，清洁饲料的环境。随机分为3 组：正常对照组（A组）、牙周炎模型组（B组）、葛根素组（C组），每组各12只，A 组不做任何处理，B 组和C 组大鼠双侧上颌第1 磨牙颊舌侧正中牙龈下，注入含20 g/L 的大肠杆菌内毒素（ELPS）的生理盐水50 µL，注入药物前1 d 丝线结扎，每间隔48 h 牙龈下注射1 次E-LPS，共注射4次，A 组则每次在同一部位注入等量的生理盐水。在术后每天仔细观察大鼠牙周状况，通过检查牙龈形态、菌斑指数、探诊出血状况、探诊牙周袋的深度，还有牙槽骨的吸收情况，从而判断口腔卫生情况、牙龈情况及牙周情况。第4 周牙周炎模型构建完成后，C 组按照葛根素液200 mg/（kg·d）灌胃给药，B 组、C 组进行等量生理盐水灌胃，均连续灌胃14 d。

1.2.2 牙槽骨吸收情况评估用颈椎脱臼法处死大鼠后，取上颌骨，并去除不符合实验标准的软组织，再用4%多聚甲醛固定24 h后，再进行显微 CT 扫描检查，并用 NRecon 软件进行三维重建。牙槽骨吸收的标准主要从以下两个方面判断：（1）定性分析：选择大鼠双侧上颌第一磨牙颊侧及舌侧的近中、中间、远中共6 个位置，测量从釉牙骨质界（cementoenamel junction，CEJ）至牙槽嵴顶（alveolar bone crest，ABC）的垂直度间距（CEJ-ABC）；（2）定量分析：通过对比不同组大鼠牙槽骨骨小梁厚度（trabecular thickness）、骨小梁分离度（trabecular separation）、骨小梁数量（trabecular number）骨体积分数（BV/TV）、骨矿化密度（bone mineral density，BMD）等骨骼生物参数，定量分析牙槽骨吸收状况。

1.2.3 HE 染色观察大鼠牙周组织变化情况各组随机选择3 只大鼠，用颈椎脱臼法处死大鼠后，再收集上颌骨组织，4%甲醛溶液固定，3～5 d后取出组织，修整所需厚度及形态，将组织经过不同浓度乙醇脱水加工处理，石蜡包埋组织，待蜡块冷却后放置-20 ℃温度冷冻，制作切片，厚度5 µm，65 ℃的恒温箱储存6～12 h，HE 试剂盒对标本染色，HE 染色观察牙周组织及骨组织的再生。

1.2.4 流式细胞术检测全血细胞中 Th17 和 Treg细胞比例分布的变化情况取各组大鼠抗凝全血，离心5 min后，细胞沉淀，洗涤后、计数重悬。将100 µL 的细胞悬液放置于EP管，依次同时加5 µL 的CD4，FITC 和5 µL IL-17、5 µL CD25，PECyanine7；避荫孵育，离心弃上清液；用500 µL的Flow Cytometry staining buffer 重悬细胞，均匀后上机测定CD4+IL-17+细胞比例、CD4 +CD25+Foxp3+细胞所占的淋巴细胞比例。采用Accur C6 软件解析，以 IL-17 染色表示Th17、Foxp3 染色表示Treg，分析2 种细胞变化的情况。

1.2.5 免疫印迹法（Western blot）检测大鼠牙周组织中 IL-10、IL-17、RORγt 和 Foxp3 蛋白的表达情况取0.1 mg 牙周组织，加入500 µL 裂解液，准备出所需蛋白样，蛋白浓度值采用BCA 方法测定，制胶，聚丙烯酰胺凝胶电泳，预先配置1 L 转移缓冲液并冷却至4 ℃，制成PVDF 转膜，孵育所需抗体，缓冲液洗膜后，再加入ECL 的化学发光显影剂附着在膜的表面，再置入凝胶图像分析仪中，以化学光敏模式曝光显影。

1.3 统计学处理

应用SPSS22.0 软件，对统计数据进行综合分析，计量资料以（）表示，组间对比采用单因素方差分析，两两对比采用q检验，P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 葛根素对大鼠牙槽骨吸收的影响

与牙周炎模型组对比，其他2 组大鼠牙槽骨矿物质密度、骨质量和硬度均明显升高，牙周炎大鼠经葛根素干预处理治疗后，骨体积分数减少。模型组与对照组相比BV/TV 数值下降，差异有统计学意义（P＜0.05）；葛根素治疗组与模型组对比，BMD 数值升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图1、表1。

图1 各组Micro-CT 扫描重建图Fig.1 Micro-CT scan reconstruction for each group

表1 各组Micro-CT 扫描分析后骨体积分数、骨矿物质密度值（n=12，）Tab.1 BV/TV and BMD values of each group obtained by micro-CT scan analysis（n=12，）

表1 各组Micro-CT 扫描分析后骨体积分数、骨矿物质密度值（n=12，）Tab.1 BV/TV and BMD values of each group obtained by micro-CT scan analysis（n=12，）

与对照组比较，*P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05。

2.2 葛根素对牙周组织病理形态学的影响

对照组的牙周膜可见微量炎症细胞聚集，牙槽骨结构正常。模型组的牙周膜可见大量炎症细胞聚集，牙槽骨被炎症细胞破坏。葛根素组的牙根部可见明显新生骨细胞增生，牙周膜可见少量炎症细胞聚集，牙槽骨结构较整齐，见图2。

图2 HE 染色观察牙周组织形态学特征变化（×100）Fig.2 Observation of histomorphological changes in periodontal tissue by HE staining（×100）

2.3 葛根素对全血中Th17/Treg 细胞比例的影响

与对照组比较，模型组的TH17、Treg 细胞比例均升高，且TH17/Treg 的细胞比例也呈显著升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。与模型组比较，葛根素组的TH17、Treg 细胞比例均下降，且TH17/Treg 的细胞比例也是下降的，差异有统计学意义（P＜0.05），见图3～图7。

图3 全血细胞中TH17 细胞比例Fig.3 Percentage of Th17 cells in whole blood

图4 全血细胞中Treg 细胞比例Fig.4 Percentage of Treg cells in whole blood

图5 全血细胞中Th17/Treg 细胞比例Fig.5 Th17/Treg cell ratio in whole blood

图6 流式细胞术检测全血细胞中各组Th17 细胞比例变化Fig.6 Change in the proportion of Th17 cells in whole blood detected by flow cytometry

图7 流式细胞术检测全血细胞中各组Treg 细胞比例变化Fig.7 Change in the proportion of Treg cells in whole blood detected by flow cytometry

2.4 葛根素对牙周组织中IL-10、IL-17、RORγt和 Foxp3 蛋白的表达影响

IL-10、Foxp3：与对照组相比，模型组蛋白的表达量有所减少，差异有统计学意义（P＜0.05）；与模型组相比，葛根素组蛋白表达量明显上调，有差异（P＜0.05）。IL-17、RORγt ：与对照组相比，模型组蛋白表达量明显上调，有差异性（P＜0.01）；与模型组相比，葛根素组的蛋白量呈明显下降趋势，差异有统计学意义（P＜0.01）。见图8～图12。

图8 WB 检测 IL-17、RORγt、IL-10、Foxp3 蛋白表达Fig.8 Western blot detection of IL-17，RORγt，IL-10，and Foxp3 protein expression

图9 各组牙周组织中IL-10 蛋白表达分析图Fig.9 Analysis of IL-10 protein expression in periodontal tissues

图10 各组牙周组织中IL-17 蛋白表达分析图Fig.10 Analysis of IL-17 protein expression in periodontal tissues

图11 各组牙周组织中Foxp3 蛋白表达分析图Fig.11 Analysis of Foxp3 protein expression in periodontal tissues

图12 各组牙周组织中RORγt 蛋白表达分析图Fig.12 Analysis of RORγt protein expression in periodontal tissues

3 讨论

牙周病的基本病理进程中，典型的临床表现是牙龈组织血管炎症性充血、牙周袋产生、牙槽骨吸收和牙齿松动等，是一种牙周组织破坏性病变[9-10]。研究结果显示在建立大鼠牙周炎模型过程中，大鼠牙周组织炎症有一定的自愈性，这可能与大鼠自身宿主免疫反应有关，病理检测发现大鼠牙周炎与人体牙周炎表现极为相似[11]。本次实验通过对大鼠双侧上颌第1 磨牙牙颈部结扎，结合大肠杆菌内毒素（E-LPS）龈下注射的方式，成功构建了实验性大鼠牙周炎模型，在术后第4周，牙周炎模型组和葛根素组大鼠均出现牙齿牙龈红肿，探诊出血明显，颊侧探诊深度至1～2 mm，而对照组大鼠牙周相关检查均无明显异常。MicroCT 定量及定性分析模型成功后，对葛根素组连续给药14 d后，牙槽骨高度测定结果表明，牙周炎组6 个位点测定值均显著超过对照组和葛根素组，提示在牙周炎组的牙槽骨周围发生了明显炎症吸收。以上结果表明，分离牙齿游离龈，用丝线结扎的第1 磨牙牙颈部，结合大肠杆菌内毒素（E-LPS）在龈下注射4 周可诱导形成实验性的牙周炎大鼠模型，葛根素对大鼠牙周炎牙槽骨吸收作用可能产生了相应的抑制效果。

葛根素（Puerarin）亦名葛根黄酮，其功能有降血糖、降低胆固醇、抗感染、保护血管、抗氧化应激等，不良反应较小，故称为"植物雌激素"[12]。已有研究证实葛根素具有抗炎活性且具有较高的生物安全性，异黄酮是调节抗炎作用的主要活性成分[6]。吴琳琳等[13]发现葛根素在适宜的含量浓度影响下，可有效促使人牙周膜干细胞（hPDLSCs）向成骨细胞分化，为在口腔中有效防治牙槽骨吸收所引起的牙周病提供有关理论依据。上述研究均证实了葛根素可以有效控制牙槽骨吸收，而且在本次研究中发现，与牙周炎模型组对比，葛根素组CEJ 到ABC 距离的减小，经葛根素处理治疗后骨体积分数有所减少，且病理学检测也显示，葛根素组牙槽骨炎症细胞浸润情况对比其他2 组均相对较少，以上结果表明葛根素可减轻或终止大鼠牙周组织的破坏，但对于具体影响机制，目前尚不明确，本研究初步探索葛根素对牙周炎大鼠Th17/ Treg 细胞免疫平衡的相关影响。

近期科学研究证实，Th17、Treg 细胞之间比例的失调，与牙周炎的发生密切相关[14]。研究发现CD4 阳性T 细胞的2 种亚类：Treg 细胞和Th17 细胞，前者产生IL-10 和TGF-β，主要控制相关免疫反应；后者主要分泌IL-17，IL-17 为最早参加抗感染的免疫效应细胞，在人类固有免疫中起关键作用[15]。据有关科学研究证实，Th17细胞可诱导炎症的产生与传播，而Treg 细胞则可以维持自身耐受性，进而控制自身免疫[16]。现今，Th17 细胞与Treg 细胞的免疫平衡状态通常是诊断治疗相关自身免疫病变的关键性靶点。Th17 常常以释放促炎因子IL-17 为其主要的特点，有STAT 依赖的特异性的转录因子维甲酸相关孤核受 体（retinoid-related orphan nuclear receptor γt，RORγt ）的加入参与，启动了其受体生长增殖与分化过程，有独特的调控机制，诱导RORγt 蛋白表达并促进了Th17 细胞分化[17]。2008年，Cardoso等[18]应用免疫荧光法，双标定位CD4 和IL-17，第一次发现并证实了牙周炎患者牙周组织中存在大量Th17 细胞。Mistry等[19]研究表明，经过治疗的牙周炎病人龈沟液中IL-17 的浓度含量已显著减少，因此IL-17 可用作评价防治牙周炎有效性的重要指标。Glowczy等[20]通过减少Th17 细胞的含量，从而减弱宿主免疫炎性反应和骨破坏作用。本次实验研究通过测定每组12 只大鼠，观察全血中Th17 细胞比例的变化，检测结果显示牙周炎模型组对比葛根素组，Th17 细胞比例显著升高，而且，转录因子RORγt 同分泌因子 IL-17 的蛋白表达量也升高，经过葛根素治疗干扰之后，其结果相反，说明在牙周炎病理进展中，Th17 细胞分化产生RORγt、IL-17，进一步加剧了牙周组织炎症反应，同时也提示葛根素可调控Th17 细胞减缓牙周组织的炎性反应。

调节性T 细胞是一类CD4+Foxp3+T 细胞亚群，拥有调控其他白细胞数量的特殊功能[21]。Treg 细胞可以通过控制自身免疫、调控免疫应答来减少有关炎症性的反应，其特异性转录因子：Foxp3，主要分泌因子：IL-10。在牙周炎的病理变化过程中，Treg 细胞数量显著增加，能更有效起到对宿主防护的效果。Parachuru等[22]研究也证实，对比牙周炎模型组，健康对照组中Foxp3、IL-10 蛋白表达量高，说明Treg 细胞及其相关因子Foxp3、IL-10，可调控牙周炎的产生。Nakajima等[23]研究表明在牙周炎中，对比观察牙龈炎、健康对照组，Foxp3、TGF-β 以及IL-10 的表达量明显增高。Kei等[24]的研究结果表明，在牙周炎小鼠龈下局部注入烟草提取物质后，在牙周组织中，Treg 细胞活力大幅下降且Foxp3、IL-10 表达水平也明显降低，而与此相反，Th17 细胞活力、RORγt 和IL-17 蛋白表达水平则大幅度增高，因此小鼠的牙周组织炎性反应增加，常常伴随着牙槽骨吸收的增加。本次实验结果表明，与对照组相比，牙周炎模型组的Th17 细胞与Treg 细胞值均升高，Th17/Treg 细胞的比例也显著增高，而葛根素组Th17 细胞和Treg 细胞值均下降，Th17/Treg细胞的比例也处于持续降低，这提示葛根素治疗干预之后，牙周炎引起的相关免疫系统反应可选择性地去重新招募Treg 细胞，从而进一步有效抑制牙周组织炎症反应。进一步分析葛根素干预后的牙周炎大鼠，其全血中Th17 细胞表达量明显减少，而Treg 细胞表达量显著增加，同时Th17/Treg 细胞比值也明显下降，说明葛根素干预治疗后牙周宿主免疫反应在向着促进牙周组织愈合的有利方向发展，通过控制Th17/Treg 细胞表达量来缓解牙周组织的炎症性反应。

综上所述，菌斑微生物常常是口腔牙周炎的始动因子，而宿主免疫反应正是造成牙周组织损害的最重要的因素。如果牙周组织中炎症持续存在，免疫细胞活跃，参与炎症反应过程中发挥双重作用，有利方面是吞噬病原菌，阻止细菌入侵;不利于牙周组织愈合方面是免疫细胞分泌各种细胞因子，最终导致牙周支持组织的损伤甚至丧失[25-27]。此次研究结果提示葛根素可以调节实验性大鼠牙周炎Th17/Treg 细胞表达量，进而影响相关因子表达，使Th17/Treg 细胞及相关因子向有利于牙周组织愈合方向发展，降低相关炎症因子的表达，从而减少牙周组织炎症水肿反应及牙周组织破坏。但是，葛根素对牙周炎大鼠具体作用机制仍需要进一步研究探讨。