lncRNA 前列腺癌相关转录物6及miR-16在人脑胶质瘤组织中的表达及其与预后的关系

王钢 雷超 温大平

胶质瘤在原发性中枢神经系统恶性肿瘤中占40%左右[1]。有证据表明，lncRNA在许多生物学过程中起着至关重要的作用，并导致肿瘤的发生发展，其异常表达已在多种人类癌症中得到证实。前列腺癌相关转录物6(PCAT6)是一种与癌症相关的lncRNA，在结直肠癌、肺癌和膀胱癌等多种肿瘤中存在失调[2-4]。PCAT6可通过多种机制发挥致癌功能，如作为竞争性内源性RNA(ceRNA)与海绵状miRNA结合并与蛋白质结合以保持其稳定。miR-16位于人类13号染色体上，已被发现在乳腺癌、前列腺癌、慢性粒细胞白血病病人中表达下调。Yang等[5]研究发现，miR-16可通过抑制BCL2和NF-kB1/MMP9信号通路抑制胶质瘤细胞生长和侵袭。本课题组在前期预实验发现lncRNA PCAT6与miR-16之间存在结合位点，本研究旨在探讨lncRNA PCAT6和miR-16在人脑胶质瘤中的表达及意义。

对象与方法

一、对象

2016年6月～2018年6月我院病理科冻存的94例胶质瘤组织作为研究组，其中男性60例，女性34例；年龄28～74岁，平均年龄(56.49±11.37)岁；根据WHO分级，将其分为低级别胶质瘤35例(I级15例，Ⅱ级20例)，高级别胶质瘤59例(Ⅲ级41例，Ⅳ级18例)。均为首次手术，且在术前均未经过放化疗。同期颅脑损伤减压术中切除的脑组织100例作为对照组，其中男性58例，女性42例；年龄26～75岁，平均年龄(57.38±10.92)岁。两组受试者性别、年龄等比较差异无统计学意义。

二、方法

1.实时荧光定量PCR(qRT-PCR)：通过Trizol法提取各组受试者组织标本的总RNA，并测定RNA的浓度和纯度。通过PrimeScriptTM RT Master Mix反转录试剂盒(Takara，日本)进行反转录，反应体系为：cDNA产物2 μl，2×SYBR® Premix Ex Taq TM II 8 μl，上下游引物各1 μl，50×ROX Reference Dye 0.4 μl，RNase-Free H2O 7.6 μl。反应条件为： 95 ℃ 10 min；95 ℃ 10 s、62 ℃ 20 s、72 ℃ 10 s，共40个循环。lncRNA-PCAT6正向引物：5＇-CCCCTC CTTACTCTT GGACAAC-3＇,lncRNA-PCAT6反向引物:5＇-GACCGAATGAGGATGGAGACAC-3＇，miR-16正向引物：5＇-TAGCAGCACGTAAATATTGGCG-3＇，miR-16反向引物：5＇-GGCAAGATGCTGGCATAGCTG-3＇，U6正向引物：5＇-CTTCAGCCGGCACAGCT-3＇，U6反向引物：5＇-CGCTAATTTGCGTTCAAACG-3＇。 lncRNA-PCAT6和miR-16的表达水平以2-△△CT表示。

2.随访：本研究通过电话或门诊对研究组病人进行为期3年的术后随访，记录病人的总生存率，随访截止时间为2021年6月，随访终点为病人死亡。术后第1年，每3个月1次随访，之后每6个月1次随访。

三、统计学方法

结果

1.胶质瘤组织中lncRNA-PCAT6和miR-16的相对表达量：研究组肿瘤组织中lncRNA-PCAT6的表达量为3.82±0.36，对照组为1.06±0.09，两组比较差异有统计学意义(P<0.05，图1A)，研究组miR-16的表达量为0.45±0.03，对照组为1.12±0.09，两组比较差异有统计学意义(P<0.05，图1B)；lncRNA-PCAT6在低级别和高级别肿瘤组织中的表达量分别为2.45±0.31、5.08±0.46，差异有统计学意义(P<0.05)见图1C。miR-16在低级别和高级别肿瘤组织中的表达量分别为0.68±0.08、0.31±0.04，差异有统计学意义(P<0.05)。见图1D。

A：胶质瘤组织中lncRNA-PCAT6的表达；B：胶质瘤组织中miR-16的表达；C:lncRNA-PCAT6在不同级别胶质瘤组织中的表达；D：miR-16在不同级别胶质瘤组织中的表达；aP<0.05

2.胶质瘤组织中lncRNA-PCAT6、miR-16表达水平与临床病理特征的关系：本研究根据lncRNA-PCAT6(3.82±0.36)、miR-16(0.45±0.03)表达水平的平均均数，将胶质瘤病人分为高表达组和低表达组。结果发现，不同lncRNA-PCAT6、miR-16表达水平病人性别、年龄、肿瘤直径及位置等比较差异无统计学意义(P>0.05)；lncRNA-PCAT6高表达组高WHO分级的病人比例显著高于lncRNA-PCAT6低表达组，而miR-16高表达组高WHO分级的病人比例显著低于miR-16低表达组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 lncRNA-PCAT6、miR-16表达与病人临床病理特征的关系(例，%)

3.lncRNA-PCAT6、miR-16表达水平与胶质瘤病人的生存分析：lncRNA-PCAT6高表达组生存20例，3年总生存率为39.22%；lncRNA-PCAT6低表达组生存30例，3年总生存率为69.77%(图2A)。miR-16高表达组生存25例，3年总生存率为60.98%；miR-16低表达组生存16例，3年总生存率为30.19%(图2B)。

注：A：lncRNA-PCAT6；B：miR-16图2 lncRNA-PCAT6、miR-16表达水平与胶质瘤病人的生存分析

4.影响病人预后的Cox回归分析：对表1中具有统计学意义的指标进行Cox多因素回归分析后发现，高WHO分级、lncRNA-PCAT6高表达及miR-16低表达是影响病人预后的独立危险因素(P<0.05)。见表2。

表2 影响病人预后的Cox回归分析

讨论

胶质瘤病人预后较差。电离辐射、手术和化疗治疗胶质瘤取得了一些进展，但胶质瘤病人的5年生存率仍然较低。有研究表明，lncRNAs的异常表达与胶质瘤的发生有关。据报道，lncRNA HOTAIR作为ceRNA通过吸附miR-126-5p促进胶质瘤进展[6]。此外，lncRNA MALAT1可以通过miR-129/SOX2轴增强胶质瘤干细胞的活力并促进胶质瘤的发生[7]。PCAT6是一种从人类染色体1q32转录而来的lncRNA，在许多癌症中作为癌基因发挥作用。Wu等[2]研究表明，lncRNA-PCAT6调节结直肠癌细胞对5-氟尿嘧啶治疗的耐药性。Lv等[8]研究表明，lncRNA-PCAT6在人类宫颈癌中的表达显著上调，促进宫颈癌细胞增殖、迁移和侵袭，并抑制凋亡。Shi等[9]研究证实，lncRNA-PCAT6在非小细胞肺癌中表达上调。本研究结果发现，lncRNA-PCAT6在胶质瘤组织中的表达显著上调，且WHO分级越高，lncRNA-PCAT6表达水平越高；lncRNA-PCAT6高表达组中高WHO分级的病人比例显著高于lncRNA-PCAT6低表达组。本研究还发现，lncRNA-PCAT6高表达病人术后3年的生存率低于低表达病人。上述结果说明，lncRNA-PCAT6的表达水平可能与胶质瘤的恶化相关，其可能是胶质瘤的潜在预后预测因子。

有研究证明，LncRNAs可以通过靶向miRNAs来调节肿瘤的发生[10-11]。Xu等[12]研究发现，lncRNA-PCAT6可通过与miR-30的内源性竞争来加速胃癌的发生。Yan等[13]研究证明，lncRNA-PCAT6通过竞争性结合miR-330-5p促进非小细胞肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭。我们在前期通过使用在线数据库TargetScan(http:www.TargetScan.org/)进行预测，发现lncRNA-PCAT6和miR-16之间存在可能的调控靶点(尚未发表)。miR-16已被发现在人脑胶质瘤细胞中表达下调，且其可通过靶向Zyxin调控细胞的增殖、迁移和侵袭[14]。在本研究中，我们同样发现miR-16在胶质瘤组织中的表达下调，且WHO分级越高的病人，miR-16表达水平越低；miR-16高表达组中高WHO分级的病人比例显著低于miR-16低表达组；miR-16高表达病人术后3年的生存率高于低表达组。上述结果同样说明，miR-16可能是胶质瘤的潜在预后预测因子。

我们通过多因素Cox回归分析发现，lncRNA PCAT6和miR-16是影响胶质瘤病人预后的独立危险因素，这一结果提示我们在临床中需要加强对lncRNA PCAT6高表达和miR-16低表达病人的术后监测，以提前预防疾病复发。但本研究样本量较小，结果具有一定的局限性，后续还应开展大样本量的研究。