血清miR-125b-2-3p对闭合性颅脑损伤预后判断的价值分析

李建 朱林 查正江 刘杰 黄纯 李志宏

美国《发病率和死亡率周报》(Morbidity and Mortality Weekly Report,MMWR)数据显示,相比2007年,2013年颅脑损伤相关的急诊就诊量增幅超过50%,增加的主要原因是跌倒或高处坠落、物体撞击和交通事故[1]。颅脑损伤的后果包括认知障碍、行为障碍、心理障碍。徐正芹等[2]研究表明，在急性颅脑损伤中血清外泌体内泛素碳末端水解酶L1及神经丝蛋白轻链多肽可作为颅脑损伤的预后标志物。miRNA是一类长度在23 bp左右的单链RNA分子，它们不表达蛋白质，但参与转录后基因表达调控。有研究发现 ，microRNA(miRNA) 可以作为疾病生物标志物。全血或特定血液成分中的miRNA是疾病诊断和预后的潜在标志物[3-4]。有研究表明，miR-125b-2-3p与肿瘤的恶性程度有关。Meng等[5]发现，miR-125b-2-3p肾透明细胞癌预后有关，并且能够通过EGR1促进肿瘤转移。Zeng等[6]发现，lncRNA XIST/miR-125b-2-3p轴能够调节结肠癌的细胞增殖和化疗敏感度。我们通过生物信息技术分析GEO GSE123336数据集，联合我院病人血清样本进行分析，探讨血清miR-125b-2-3p与颅脑损伤病人严重程度和预后的关系。

材料与方法

1.公开数据库:(1)GEO数据库:本研究使用GEO数据集GSE123336对颅脑损伤血清miRNA进行筛选，该数据集包含了综合格斗(Mixed Martial Arts，MMA)头部击打次数，比赛前、比赛后不同时间的血清miRNA测序结果[7]，因此，这一部分数据是配对数据。由于该数据集中样本比较复杂，包含唾液和血清的测序结果。本研究不涉及唾液miRNA表达量，只选用了该数据集中的部分数据。纳入共计34个参赛者，仅分析比赛前、比赛后当天的血清数据。(2)mirPATH数据库:为了研究差异miRNA可能的机制，本研究选用mirPATH数据库对8个差异miRNA进行KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)聚类分析[8]。初步判断差异miRNA可能涉及的功能通路。

2.临床样本：本研究收集以下病人血清：闭合性颅脑损伤轻型、中型、重型、特重型。纳入标准：(1)符合主要诊断，除脑外伤以外无其他脏器外伤破裂；(2)年龄18～85周岁；(3)无严重慢性疾病病史；(4)头部创伤6小时内；(5)无长期用药史；(6)既往无精神、智力异常；(7)无严重胸腹部外伤。由于闭合性颅脑损伤轻型发病率高，样本量庞大，本研究中并不需要纳入所有的轻症病人。因此只涉及2021年4月1日～2021年4月30日期间的闭合性颅脑损伤轻型的非手术病人，共27例。闭合性颅脑损伤(中型、重型、特重型)收集的病例为2020年6月1日～2021年4月30日间接受血肿清除术的病人，共61例。我院共纳入病人88例，其中男65例，女23例。闭合性颅脑损伤轻型27例，中型13例，重型42例，特重型6例。男性病人的miR-125b-2-3p表达量为2.26±0.94，女性病人为2.02±0.96，差异无统计学意义(表1)。基线资料中格拉斯哥昏迷评分(GCS)、格拉斯哥预后评分(GOS)、住院时间与性别比较，差异无统计学意义。见表1。

表1 样本基线资料

二、方法

1.病人入院后急诊采血时顺便采集血样3 ml，置于无抗凝成分的采血管。静置于4 ℃冰箱1小时血样凝固后，在4 ℃，2 000转/分钟条件下离心15分钟，将血清和细胞成分分装进两个冻存管。将冻存管编号后冻存进-80 ℃冰箱中。

2.qRT-PCR：miRNA使用血清/血浆 miRNA提取分离试剂盒从血清中提取。每份血清样品取200 μl，提miRNA前加入cel-miR-39-3p 标准品1 μl用作外参。cel-miR-39-3p Standard RNA(miRB0000010-3-1)购自广州锐博生物技术有限公司。逆转录PCR反应使用Bulge-Loop miRNA qRT-PCR Starter Kit，在Icycling GT9612 PCR仪进行逆转录，在QuantStudio3仪器进行荧光定量PCR。目标引物使用锐博公司的Bulge-Loop miR-125b-2-3p Primer Set(MQPS0000513-1-100)。外参引物使用Bulge-Loop cel-miR-39-3p Primer Set。miRNA提取、逆转录和qRT-PCR反应步骤遵循试剂盒说明书。

3.数据库分析流程：下载数据后首先清理平均表达量≤10的miRNA，表达量过低的miRNA受到测量误差的影响较大，导致差异是随机出现的。用R语言limma包进行差异分析，差异miRNA的筛选条件为|log2FC|≥1，P≤0.001。用mirPATH数据库对差异miRNA进行KEGG聚类分析，初步判断差异miRNA可能涉及的功能通路。用mirPATH提供的miRNA-mRNA相互作用数据绘制互作网络。判断差异miRNA主要互作蛋白。

三、统计学分析

结果

1.GSE123336显示miR-125b-2-3p在颅脑创伤组血清含量显著上升：我们对GSE123336进行差异分析，设置筛选条件为|log2FC|≥1，P≤0.001。显著差异的miRNA一共8个(图1A)，其中显著性最高的3个miRNA见表2。由于miR-125b-2-3p在数据库中的显著性要高于miR-10b-5p。因此，我们选择miR-125b-2-3p进行进一步研究。使用mirPATH数据库对8个差异进行KEGG富集分析后发现，差异miRNA功能主要富集在以下通路(图1B)：Renal cell carcinoma,Glycosphingolipid biosynthesis,Proteoglycans in cancer,Ubiquitin mediated proteolysis,TGF-beta signaling pathway,MAPK signaling pathway,Mucin type O-Glycan biosynthesis,Sphingolipid signaling pathway,Non-small cell lung cancer。将miR-125b-2-3p和富集分析中的互作基因提取出来构建互作网络(图1C)。

A:GEO数据集 GSE123336差异基因热图。B:mirPATH数据库对差异miRNA的富集分析结果。C:mirPATH富集分析中涉及的蛋白与miR-125b-2-3p互作网络。黄色MAPK信号通路，蓝色Sphingolipid(鞘磷脂类)信号通路，其他颜色表示其他通路

表2 Top3显著的miRNA

2.miR-125b-2-3p随着颅脑损伤严重程度显著上调：闭合性颅脑损伤轻型病人miR-125-2-3p表达量1.02±0.36，中型病人为2.23±0.53，重型病人为3.33±0.90，特重型为3.74±1.06(图2A)。相关性分析提示，miR-125b-2-3p与GCS评分呈现显著负相关，差异有统计学意义(P<0.05)。

A．颅脑损伤严重程度与miR-125b-2-3p的关系：单因素方差分析(P<0.05)，两两比较除重型和特重型之间无显著差异，其他各组两两比较均存在显著差异(P<0.05)。B.miR-125b-2-3p血清表达量和GCS评分的相关性分析miR125b-2-3p表达量和损伤严重程度的关系

3.高表达的miR-125b-2-3p预示着不良的预后：我们分析了不同GOS预后分级的miR-125b-2-3p表达量。结果显示，GOS Ⅰ/Ⅱ级miR-125b-2-3p相对表达量为4.12±0.74，Ⅲ级为为3.45±0.51，Ⅳ级为为2.40±0.66，Ⅴ级为为1.34±0.71(图3A)。越高的miR-125b-2-3p表达显预示着越差的预后(图3A)。以GOS Ⅰ/Ⅱ级为阳性事件，以GOS Ⅲ/Ⅳ级为阴性事件进行的ROC分析，ROC曲线下面积等于0.89(图3B)。这意味着miR-125b-2-3p对不良预后(GOS Ⅰ/Ⅱ级)有着较高的预测效能。

A.血清miR-125b-2-3p表达量与GOS预后分级的关系。B.ROC分析图3 miR-125b-2-3p和GOS预后的关系

讨论

颅脑损伤除了对外伤血肿压迫的早期手术治疗有明确疗效外，并不存在特效的治疗方法。重度颅脑损伤病人有相当比例的病人预后属于GOS Ⅰ级、Ⅱ级。病人预后GOS Ⅱ级实际上会比GOS Ⅰ级给家庭带来更大的负担。

2015年瑞典开展一项涉及182例颅脑损伤病人的研究，该研究指出，血清NF-L可以评估6～12个月的TBI预后，是GOS预后的独立因子[9]。李焕良等[10]研究显示，TC、LDL-C、HbA1c和空腹血糖水平是影响颅脑损伤病人预后的危险因素。类似的，血清UCH-L1可以预测轻中度颅脑损伤病人是否需要神经外科干预[11]。第二天的血清UCH-L1 浓度预示着不良预后。

生物信息技术是发现潜在分子机制的有效手段。戴嘉婧等[12]通过生物信息技术发现，与三阴性乳腺癌发生发展有关的潜在调控轴：hsa_circ_0001361/miR-93-3p/UBE2G2和hsa_circ_0002874/miR-2115-5p/DTX3L。我们对GEO GSE123336数据集进行生物信息挖掘。该研究包含了MMA比赛头部击打次数和血清miRNA测序的结果。对该数据集进行分析后我们找到top 3个最显著的差异miRNA：miR-125b-2-3p、miR-10b-5p、miR-99b-5p。而miR-125b-2-3p差异分析的P值最显著。本研究把重点放在miR-125b-2-3p。结果显示，血清miR-125b-2-3p在头部外伤后显著增加。进一步分析发现，miR-125b-2-3p和其他差异miRNA共同富集到以下通路：Renal cell carcinoma Glycosphingolipid biosynthesis,Proteoglycans in cancer,Ubiquitin mediated proteolysis,TGF-beta signaling pathway,MAPK signaling pathway,Mucin type O-Glycan biosynthesis,Sphingolipid signaling pathway,Non-small cell lung cancer。富集的通路中与miR-125b-2-3p互作的蛋白主要涉及MAPK通路和Sphingolipid(鞘磷脂类)信号通路；而MAPK通路与缺血再灌注损伤、炎症损伤有明确关系[13-14]。Sphingolipid信号影响细胞结局和免疫应答[15]。血清miR-125b-2-3p的表达量改变可能是由于颅脑损伤后脑细胞内miR-125b-2-3p入血。而在脑细胞内失调的miR-125b-2-3p可能影响病人最终结局。

血清miR-125b-2-3p的表达量随着颅脑损伤严重程度的增加显著增加(P<0.05)。但在重型和特重型无显著差异，这可能是由于特重型病人样本量不足导致。相关性分析发现GCS评分和miR-125b-2-3p呈显著负相关，P<0.05。进一步分析发现随着GOS预后分级的增高，miR-125b-2-3p显著降低。GOS预后分级等级越高表明预后越好。因此我们可以得出结论，血清miR-125b-2-3p是潜在的颅脑外伤预后标志物。为了判断预测效能，我们进行了ROC分析。结果显示，miR-125b-2-3p对GOS Ⅰ/Ⅱ级的ROC曲线下面积达到0.89。预测效能较好。

黎入荧[16]的一项研究成果显示，脑梗死病人外泌体源性miR-125b-2-3p表达量对脑梗死有较好的诊断效能。该研究发现，在脑梗死病人中外泌体源性miR-125b-2-3p在血浆中表达显著上调。这与我们的研究相符合，但黎入荧[16]发现，外泌体miR-125b-2-3p表达水平与神经功能缺损严重程度无关，与脑梗死严重程度无关，这与我们研究趋势不相符合。可能的原因是黎入荧检测的是血清外泌体，而我们的研究并未局限在外泌体。另外，颅脑损伤miR-125b-2-3p释放机制可能与脑梗死不同，损伤可能更倾向于细胞损伤后直接释放入血。有研究指出，血清miR-125b-5p表达水平在急性缺血性脑卒中病人中明显升高,且与Hcy、Hs-CRP及MMP-9水平相关[17]。miR-125b-5p和miR-125b-2-3p是不同的miR-125b成熟体，现有的研究成果表明，在中枢疾患中，miR-125b家族的表达量受到影响。miR-125b-2-3p在颅脑损伤中属于较新颖的发现。

本研究结果提示，血清miR-125b-2-3p表达量是潜在的闭合性颅脑损伤病人预后标志物。较高的血清miR-125b-2-3p表达量预示着不良预后。