重金属镉对於术种子萌发及其生理指标的影响

周海珺，杜佳鑫，杜向标，白岩

（1.浙江省龙泉市城区林业工作站，浙江 龙泉 323700；2.浙江省龙泉市剑池街道办事处，浙江 龙泉 323700；3.浙江农林大学 食品与健康学院，浙江省特色中药资源保护与创新利用重点实验室，浙江 杭州 311300）

白术Atractylodes macrocephala属菊科Compositae 苍术属Atractylodes多年生草本植物[1]，以根茎入药，具有健脾益气、燥湿利水、止汗、安胎等功效，用于脾虚食少、腹胀泄泻、痰饮眩悸、水肿、自汗、胎动不安等。现代研究表明，白术含有苍术酮、苍术醇、白术内酯等主要成分[2]，具有调节免疫[3]、抗肿瘤[4]、抗衰老、抗炎、抑菌、扩张血管、降血糖等药理作用[5]。其中，产于浙江临安於潜的白术被称为於术A.macrocephala‘Yuzhu’，亦名于术，品质优异，药效显著，为道地药材。

重金属Cd 直接影响植物的生理生化和生长发育，具有明显的剂量效应。当Cd2+超过一定浓度后，对叶绿素有破坏作用，并促进抗坏血酸分解，使游离脯氨酸积累，抑制硝酸还原酶活性[6]。进入植物体的Cd2+常会改变细胞膜透性[7]，对叶绿体、线粒体、细胞核等亚显微结构都有一定程度的破坏作用[8]，并且竞争性地取代某些酶活性中心的金属元素而影响酶的正常活性，从而引起植物光合作用、呼吸作用、氮素代谢、核酸代谢等一系列生理过程的紊乱[9]。目前，国内外对重金属如何危害蔬菜粮食作物的研究较多，有关重金属Cd 如何影响中草药的研究很少，因而本研究可以丰富Cd2+胁迫中草药的相关研究内容。临安地处江南，酸雨较多，促进当地红壤中的Cd2+释放；同时，於术以种子进行繁殖，并且没有休眠习性，发芽较容易，因而容易受到土壤和水体中的Cd2+污染，影响其发芽和生理指标，进而影响其药材的品质和质量。本研究设置Cd2+不同浓度梯度，考察其对於术种子萌发及其生理指标的影响，以期为於术安全生产以及药材质量安全控制提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

本研究所用於术种子来源于浙江临安童家村於术种植基地。试验所用材料CdCl2、KNO3、NaNO2、Na2HPO4·12H2O、对羟基苯磺酸、冰乙酸、盐酸、H2O2、三氯乙酸、无水醋酸钠、蒽酮、考马斯亮蓝、牛血清蛋白、葡萄糖、0.4% TTC、邻甲氧基苯酚、乙酸乙酯、浓H2SO4、保险粉、无水乙醇、甲萘胺均购自浙江华东医药有限公司，除甲萘胺为化学纯，其余均为分析纯。

实验所用仪器有紫外分光光计（上海恒平752 型）、电子天平（北京赛多利斯XPR204S/AC 型）、电热恒温鼓风干燥箱（上海博迅DHG-9053A 型）、电热恒温培养箱（黄石恒丰SKP-02B 型）、台式低速离心机（瑞沃德M-F24 型）、电子恒温水浴锅（北京光明HH-8 型）、游标卡尺（霍夫曼TESA-CALIP67）。

1.2 试验方法

用去离子水将CdCl2配制成100 mg·L-1的母液，然后依次稀释成0.1、1.0、5.0、10.0、30.0、50.0、100.0 mg·L-1（以Cd2+计）溶液。将大小均匀一致、籽粒饱满、无病虫害的於术种子消毒后，等量分成8 份，其中7 份种子分别用配置好的7 种浓度Cd2+溶液浸种（加试液用量约为种子量的3 倍），1 份以清水浸种（0 mg·L-1）为对照，共计8 个处理。浸种10 h 后，在培养皿内放两层滤纸，用相应浓度的Cd2+溶液充分润湿，将种子平铺于滤纸上，每个培养皿放置50 粒於术种子，加盖后，室温下催芽并每天向培养皿中加入相应浓度的溶液，使滤纸保持湿润。每个处理设置3 个培养皿，即3 次重复，取平均值作为试验数据。

浸种后催芽3 d，当於术种子种胚突破种皮时调查发芽势，以萌动种子数量占处理种子总数量的百分率表示。浸种6 d 后，当胚根与种子等长或胚芽长到种子长度的一半时，调查发芽率，以发芽种子占处理种子的百分率表示。出芽3～ 5 d 时，随机取出已发芽於术种子50 粒，测量根长和芽长。采用TTC 比色法、磺胺比色法、蒽酮比色法、考马斯亮蓝G250法分别测定根的活力、硝酸还原酶含量、可溶性糖含量和可溶性蛋白含量[8]。

1.3 数据分析

试验数据通过SPSS 22.0 和Origin 软件进行方差分析及作图。

2 结果与分析

2.1 Cd 2+浓度对於术种子萌发的影响

Cd2+浓度对於术种子萌发的影响见图1。由图1 可知，於术种子的发芽势和发芽率均随着Cd2+浓度的增加呈先增加后下降的趋势。对照於术种子的发芽势和发芽率分别为55.12%和65.01%。此后，随着Cd2+浓度的增大，於术种子的发芽势和发芽率随之升高。当Cd2+浓度为10.0 mg·L-1时，於术种子的发芽势和发芽率均升至最大值，分别为66.91%和77.53%，分别比对照提高了20.12%和19.27%。当Cd2+浓度继续增大时，於术种子的发芽势和发芽率随之下降，当Cd2+浓度增大至100.0 mg·L-1时，於术种子的发芽势和发芽率降至最低，分别为41.81%和49.19%，分别比对照降低了24.14%和24.33%，抑制效果显著。

图1 Cd2+浓度对於术种子萌发的影响Figure 1 Effect of different concentration of Cd2+ on seed germination of A.macrocephala ‘Yuzhu’

2.2 Cd 2+浓度对於术种子芽长和幼根的影响

Cd2+浓度对於术种子芽长和幼根的影响见图2。由图可知，於术种子的芽长和根长均随着Cd2+浓度的增加呈先增加后下降的趋势。对照於术种子的芽长和根长分别为0.75 cm 和3.25 cm。此后，随着Cd2+浓度的增大，於术种子的芽长和根长随之升高，当Cd2+浓度为10.0 mg·L-1时，於术种子的芽长和根长升至最大值，分别为1.35 cm 和4.66 cm，分别比对照提高了79.73%和35.44%。当Cd2+浓度继续增大时，於术种子的芽长和根长随之下降，当Cd2+浓度增大至100.0 mg·L-1时，於术种子的芽长和根长降至最低值，分别为0.52 cm 和2.48 cm，分别比对照降低了31.08%和23.42%，与各处理均差异显著（P＜0.05）。

图2 Cd2+浓度对於术种子芽长和根长的影响Figure 2 Effect of different concentration of Cd2+ on length of bud and root of A.macrocephala ‘Yuzhu’

2.3 Cd 2+浓度对於术种子根系活力的影响

Cd2+浓度对於术种子根系活力的影响见图3。由图3 可知，於术种子的根系活力随着Cd2+浓度的增加呈先增加后下降的趋势。对照於术的根系活力为36.01 μg·根-1·h-1。此后，随着Cd2+浓度的增大，於术种子的根系活力随之升高，当Cd2+浓度为10.0 mg·L-1时，於术种子的根系活力最强，为84.62 μg·根-1·h-1，比对照提高了2.35倍。当Cd2+浓度继续增大时，於术种子的根系活力开始下降。当Cd2+浓度增大至100.0 mg·L-1时，於术的根系活力降至最低值，为28.41 μg·根-1·h-1，比对照下降了21.14%。

图3 Cd2+浓度对於术种子根系活力的影响Figure 3 Effect of different concentration of Cd2+ on root activity of A.macrocephala cv.Yuzhu

2.4 Cd 2+浓度对於术种子硝酸还原酶含量、可溶性总糖含量、可溶性蛋白含量的影响

2.4.1 对硝酸还原酶含量的影响 Cd2+浓度对於术种子硝酸还原酶含量的影响见图4。由图4 可知，於术种子的硝酸还原酶含量随着Cd2+浓度的增加呈先增加后下降的趋势。对照於术种子的硝酸还原酶含量为1.48 μg·g-1·h-1。此后，随着Cd2+浓度的增加，於术种子的硝酸还原酶含量也随之升高，当Cd2+浓度达到10.0 mg·L-1时，於术种子的硝酸还原酶含量达到最大值，为3.12 μg·g-1·h-1，比对照提高了2.11 倍，与对照和其他处理间均差异显著（P＜0.05）。当Cd2+浓度继续增大时，於术种子的硝酸还原酶含量开始下降。当Cd2+浓度达到100.0 mg·L-1时，於术种子的硝酸还原酶含量达到最小值，为1.21 μg·g-1·h-1，比对照下降了17.92%。

图4 Cd2+浓度对於术种子硝酸还原酶的影响Figure 4 Effect of different concentration of Cd2+ on nitrate reductase of A.macrocephala ‘Yuzhu’ seed

2.4.2 对可溶性糖含量的影响 Cd2+浓度对於术种子可溶性糖含量的影响见图5。由图5 可知，於术种子中的可溶性糖含量随着Cd2+浓度的增加呈先增加后下降的趋势。对照於术种子的可溶性糖含量为11.82 μg·g-1。此后，随着Cd2+浓度的增大，於术种子的可溶性糖含量也随之升高，当Cd2+浓度达到10.0 mg·L-1时，於术种子的可溶性糖含量达到最大值，为16.56 μg·g-1，比对照提高了40.09%。当Cd2+浓度继续增大时，於术种子的可溶性糖含量开始下降。当Cd2+浓度浓度达到100.0 mg·L-1时，於术种子的可溶性糖含量达到最小值，为7.82 μg·g-1，比对照下降了33.89%。

图5 Cd2+浓度对於术种子可溶性糖含量的影响Figure 5 Effect of different concentration of Cd2+ on soluble sugar content of A.macrocephala ‘Yuzhu’

2.4.3 对可溶性蛋白含量的影响 Cd2+浓度对於术种子可溶性蛋白含量的影响见图6。由图6 可知，於术种子的可溶性蛋白含量随着Cd2+浓度的增加呈先增加后下降的趋势。对照於术种子的可溶性蛋白含量为16.67 μg·g-1。此后随着Cd2+浓度的增大，於术种子的可溶性蛋白含量也随之升高，当Cd2+浓度达到10.0 mg·L-1时，於术种子的可溶性蛋白含量达到最大值，为33.58 μg·g-1，比对照提高了2.01 倍。当Cd2+浓度继续增大时，於术种子的可溶性蛋白含量开始下降。当浓度达到100.0 mg·L-1时，於术种子可溶性蛋白含量降至最小值，为13.69 μg·g-1，比对照下降了17.87%。

图6 Cd2+浓度对於术种子可溶性蛋白含量的影响Figure 6 Effect of different concentration of Cd2+ on soluble protein content of A.macrocephala ‘Yuzhu’

2.5 Cd 2+浓度对於术种子影响的相关性分析

Cd2+浓度与於术种子萌发及生化指标的相关性如表1。由表1 可知，Cd2+浓度与所有於术种子发芽和生长指标之间均存在负相关性，相关系数在-0.873 78～ -0.447 61 之间；发芽势、发芽率、芽长、幼根长、根系活力、硝酸还原酶含量、可溶性糖含量、可溶性蛋白含量之间均为正相关，其中根长和发芽势、发芽率、可溶性糖含量之间呈极显著相关(P＜0.01)，与芽长显著相关（P＜0.05）。

表1 Cd2+浓度与於术种子萌发及各生理指标的相关性Table 1 Correlation analysis of Cd2+ concentration with seed germination and physiological traits of A.macrocephala ‘Yuzhu’

3 讨论与结论

Cd 是一种生物非必需的重金属元素，由于具有高毒性且在水体中较为稳定，是主要的重金属污染物之一。本研究结果表明Cd2+对於术种子萌发及其生理指标的影响具有明显的剂量效应，即低浓度Cd2+（≤10.0 mg·L-1，下同）对於术种子的发芽势、芽和幼根长度、根活力、硝酸还原酶含量、可溶性糖含量、可溶性蛋白含量具有一定的促进作用，而高浓度Cd2+（20～100 mg·L-1）则对其具有较为显著的抑制作用。这与白嵩[10]以水稻Oryza sativa、张玲[11]和江虎生[12]等以小麦Triticum aestivum、付世景[13]以板蓝根Isatis tinctoria为试验材料的研究结果基本一致，均表现出了“低促高抑”的规律。

硝酸还原酶[14-15]是一种氧化还原酶，位于细胞质内或细胞膜外，在硝酸盐还原途径中是限速因子，可通过NADH 和NADPH 其中之一或两者(双功能) 提供两个电子催化反应，催化硝酸离子还原成亚硝酸离子的反应，植物生长发育过程中的重要生理生化指标。可溶性糖[15-16]主要包括葡萄糖、海藻糖、蔗糖等，是参与植物生长发育的重要物质，也在遭遇到逆境胁迫时起到渗透调节作用，并在维持植物蛋白质稳定方面起到重要作用。植物体内的可溶性蛋白质大多数是参与各种代谢的酶类，是一个重要的生理生化指标，可以指征植物体总代谢水平和活跃度。皮尔森（Pearson）分析结果说明，随着Cd2+浓度的增加，以上几个生长和代谢指标受到的抑制均越来越显著，同时和於术种子的发芽能力呈高度正相关。

Cd 作为环境污染中最为危险的因子之一，常常存在于水体、土壤或肥料中，通过进入植物体内并不断积累，尤其是富集鱼根部较多，可以进一步引发人类的多种疾病。但是应该注意的是，尽管多项研究显示低浓度Cd2+可以提升多种植物种子的发芽状况和早期生长指标，但是伴随植物的生长及富集，植物就会出现各种毒害的症状，从而影响正常额生长发育，并将影响产量和品质，同时成为有毒的农产品及原药材。

本研究结果揭示了Cd2+浓度对於术种子的发芽影响具有“低促高抑”的规律，探讨种子萌发期间对Cd2+浓度的反应，所得数据可为於术安全生产以及於术药材质量安全控制提供科学依据。相关Cd2+浓度影响於术的根茎膨大及品质形成的研究，将在下一步研究中揭示，并为於术药材质量安全控制提供参考。