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青钱柳叶片总黄酮含量测定及代谢组学分析

2022-11-15肖艺欣朱锦懋陈由强陈建楠

关键词:黄酮醇青钱柳老叶

肖艺欣,朱锦懋,陈由强,陈建楠

(福建师范大学生命科学学院,福建 福州 350117;福建师范大学南方海洋研究院,福建 福州 350117 )

青钱柳(Cyclocaryapaliurus),又名青钱李、山麻柳、山化树等,是胡桃科(Juglandaceae)青钱柳属(Cyclocarya)的乔木,在安徽、浙江、福建、湖南等地较常见[1].青钱柳叶为奇数羽状复叶,呈长椭圆状卵形,常被晒干制成茶,其水提物对降血糖有较显著的作用[2-3].将青钱柳叶磨成细粉与茶叶混配,不仅在降血糖方面的功效倍增,还能改善人体的耐糖量,具有养生功效[4].近年来,青钱柳的天然保健功能逐渐受到人们重视,叶片中的黄酮类化合物作为主要药用成分之一,在抗氧化、降血脂、调节肠道菌群以及抗炎等方面发挥一定的作用[5-10].

黄酮类化合物是一类自然界中广泛存在的多酚类物质.按照母核结构的不同,主要有黄酮、黄酮醇及其苷、二氢黄酮及其苷、二氢黄酮醇及其苷、黄烷类化合物、花青素类化合物、查尔酮、二氢查尔酮、橙酮类化合物以及双黄酮类化合物[11].常用的提取方法有超声辅助提取、酶辅助提取、溶剂提取等[12-15].总黄酮含量的常用检测方法为紫外分光光度法,该种方法简单且高效.为了进一步确定其具体化学成分,可将粗提后的提取液进行分离纯化,采用高效液相色谱、超高效液相法、核磁共振法鉴定分析[16-19].

福建安溪桃舟的土壤适宜青钱柳生长,青钱柳树叶含有丰富的皂苷、黄酮等代谢物成分,能有效降低血糖.代谢物是生物体表型的基础,其能更直观、有效地了解生物学过程及其机理[19].由于产地环境不同,青钱柳生理进程存在差异,导致代谢产物的种类与含量发生变化,适宜采收的时期也有所不同.例如,湖南江华和江西庐山的最佳采收期为7月,而浙江是4—5月[20-21].本研究检测福建安溪青钱柳采摘季(4—11月)叶片总黄酮的含量,分析不同月份青钱柳叶片总黄酮含量的变化趋势,旨在为该地区以黄酮为指标的青钱柳相关生产提供科学依据.10月为安溪采摘青钱柳的月份,以10月不同生长阶段的叶片为研究对象,采用超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)技术检测,比较该月份老叶(10M-OL)、中叶(10M-ML)和嫩叶(10M-YL)黄酮类代谢物的差异,为进一步开发和生产青钱柳相关产品提供理论指导.该方法对设备要求简单,操作简便且易于推广普及.

1 材料与方法

1.1 试验材料

青钱柳样本取自福建泉州市安溪县桃舟乡(E117°45′42′,N25°22′48′),该地属亚热带海洋性季风气候,年平均降水量1 840 mm.采样时间为2021年4—11月,在样地选取4~6株植株高度一致且株型相似的植株,每株分别采摘100~300片中叶(长度为5~10 cm)混合为实验样本.2021年10月选取4~6株植株高度一致且株型大小相似的植株,每株分别采摘老叶(叶片长度大于10 cm)、中叶(叶片长度为5~10 cm)、嫩叶(叶片长度小于5 cm)各100~300片作为实验样品.样品采集后放入自封袋,带回实验室于-80 ℃冰箱保存,待后续实验使用.4—11月中叶样品及10月老叶、中叶、嫩叶样品1式3份作为生物学重复.

1.2 主要试剂和仪器

1.2.1 主要试剂

芦丁标准品(纯度95%,上海阿拉丁生化科技股份有限公司);无水乙醇(分析纯,西陇科学股份有限公司);硝酸铝(分析纯,西陇化工股份有限公司);醋酸钾(分析纯,西陇化工股份有限公司);甲醇(色谱纯,美国Merck公司);乙腈(色谱纯,美国Merck公司).

1.2.2 主要仪器

多功能微孔板检测仪(Infinite 200 pro,TECAN上海贸易有限公司);真空冷冻干燥机(LGJ-10,北京松源华兴科技发展有限公司);全自动样品快速研磨仪(JXFSTPRP-64,上海净信实业发展有限公司);数控超声波清洗器(KQ-500DE,昆山市超声仪器有限公司);超高效液相色谱(Nexera X2,日本SHIMADZU公司);串联质谱(4500 QTRAP,美国Applied Biosystems公司); 奥豪斯电子天平(CP114,奥豪斯国际贸易(上海)有限公司).

1.3 实验方法

叶片中总黄酮含量的检测主要参考中华人民共和国出入境检验检疫行业标准《SN/T4592-2016出口食品中总黄酮的测定》.

1.3.1 标准曲线测定

称取0.050 g芦丁标准品,用无水乙醇溶解并定容于50 mL容量瓶,得到芦丁标准溶液.称取17.600 g九水合硝酸铝,用蒸馏水溶解并定容于100 mL容量瓶,得到硝酸铝溶液.称取9.814 g醋酸钾,蒸馏水溶解,并定容于100 mL容量瓶,得到醋酸钾溶液.

从芦丁标准溶液中移取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL于50 mL容量瓶,分别加入14.0、13.0、12.0、11.0、10.0 mL无水乙醇使容量瓶内的液体体积补充至15.0 mL.再依次向各个容量瓶中加入1.0 mL硝酸铝溶液、1.0 mL醋酸钾溶液,最后蒸馏水定容至50.0 mL.室温静置1 h后,在波长420 nm下测定吸光度值.

1.3.2 总黄酮测定的样品处理

将各月份的青钱柳中叶置于真空冷冻干燥机中冻干24 h,称取1.500 g冻干样品,采用全自动样品快速研磨仪粉碎.粉碎后的样品置于100 mL锥形瓶,加入30.0 mL无水乙醇,40 ℃,以50%功率超声1 h,每20 min摇晃均匀一次.超声完毕将滤液回收过滤至50 mL容量瓶,无水乙醇定容.

从定容后的液体中移取1.0 mL于50 mL容量瓶,加入14.0 mL无水乙醇将容量瓶内的液体补充至15.0 mL,样品溶液测定步骤参照1.3.1标准曲线测定.

1.3.3 UPLC-MS/MS的样品处理

将10月青钱柳老叶(10M-OL)、中叶(10M-ML)和嫩叶(10M-YL)分为3组,每组样品为3个生物学重复进行代谢研究.样品置于真空冷冻干燥机中冻干,研磨仪研磨至粉末状.称取0.100 g粉末,溶解于1.2 mL体积分数70%的甲醇提取液中,每30 min涡旋一次,每次持续30 s,共涡旋6次,样本置于4 ℃冰箱过夜,离心取上清液,用微孔滤膜过滤样品,并保存于进样瓶中.每个月份样本3个生物学重复,用于UPLC-MS/MS分析.

1.3.4 UPLC-MS/MS的检测条件

采集检测仪器主要为超高效液相色谱(UPLC)和串联质谱(MS/MS).主要液相条件如下:色谱柱Agilent SB-C18(1.8 μm,2.1 mm×100 mm);柱箱温度40 ℃;进样体积为4 μL;流动相A为超纯水(体积分数0.1%色谱级甲酸),B为乙腈(体积分数0.1%色谱级甲酸),流速0.35 mL·min-1.梯度洗脱:0~9 min,95%A;9~10 min,5%A;10~11 min,95%A;11~14 min,5%A.

主要质谱条件如下:正、负离子模式;离子喷雾电压(IS)分别设置为正离子模式5 500 V,负离子模式-4 500 V;离子源,涡轮喷雾电离;温度550 ℃;离子源气体I(GSI)、气体Ⅱ(GSII)和帘气(CUR)分别设置为344.750、413.700、172.375 kPa.

1.4 数据处理

总黄酮含量数据采用Excel作图,以SPSS25.0软件进行方差分析,通过Duncan法进行多重比较.代谢组数据利用Analyst 1.6.3软件处理.采用TBtools、Origin2021、GraphPad Prism9.0作图.

2 结果与分析

2.1 标准曲线的绘制

以50.0 mL芦丁标准溶液中芦丁的质量(mg)为横坐标,吸光度为纵坐标,测得回归方程为y=0.382x+0.028,r2=0.999,计算样品中的总黄酮提取率.

2.2 青钱柳叶片中总黄酮含量及变化规律

2021年4—11月,青钱柳叶片总黄酮含量最高为4月(11.84 mg·g-1),最低为5月(6.95 mg·g-1),含量表现出降低-增加-降低的双峰特征,具体变化趋势见图1.由图1可知,5—6月,总黄酮含量相较于其他几个月更低,次生代谢物的积累较少,该时期多雨,对代谢物积累产生影响.7—10月,正属于青钱柳的成熟结果期,在气候适宜的福建,黄酮次生代谢物的积累相对较多,因此对7—10月的青钱柳叶片做进一步研究更有意义.

图1 不同月份青钱柳叶片总黄酮含量的变化趋势

对4—11月总黄酮含量进行单因素方差分析,结果显示P=0.109 > 0.05,说明该方差为齐性.因此采用Duncan多重比较法,对8个不同月份的青钱柳叶片总黄酮含量进行分析,结果如图2.由图2可知,4月与6、9、10月无显著差异,但是与8、11月差异显著(P<0.05),且与5月差异极显著(P< 0.01).5月与7月差异显著(P<0.05).结合多重比较分析,结果表明,4、7、10月为适宜采摘青钱柳叶片的时间.

*为差异显著(P<0.05),**为差异极显著(P<0.01)

2.3 UPLC-MS/MS检测结果

基于UPLC-MS/MS检测平台和自建数据库,共检测到10月老、中、嫩叶中751个代谢物,其中,物质一级分类为黄酮类的代谢物有144个.对主要代谢物进行定性和定量分析,老叶中含量排名前五的代谢物多集中于黄酮、黄酮醇这2类代谢产物;中叶多集中于花青素、黄酮、黄酮醇这3类代谢产物;嫩叶多集中于黄酮醇、黄酮这2类代谢产物.具体代谢物类型及比例见表1.不同生长阶段叶片中均含有黄酮、黄酮醇这2类代谢产物;与嫩叶、老叶相比,中叶含有花青素类代谢产物.老叶的黄酮化合物总体含量较高;中叶的花青素化合物总体含量较高;嫩叶的黄酮化合物总体含量较高.其中,山奈酚、矢车菊素这2类代谢物在老、中、嫩叶中含量均较多.

表1 不同叶龄中含量排名前五的黄酮类代谢物

2.3.1 主成分分析

对质控后的样品数据进行主成分分析(principal component analysis,PCA),将原始数据投射到新的坐标系统中,第一主成分为第一坐标轴,第二主成分为第二坐标轴.第一主成分代表在原始数据中各变量经过变换得到的新变量的变化区间;第二主成分代表在原始数据中各变量经过变换得到的第二个变量的变化区间,PCA得分图如图3.在PCA得分图中,叶片3个不同生长阶段能够明显区分,即同一个生长阶段的代谢产物生物学重复存在一定的相似性,而老叶、中叶、嫩叶这3个生长阶段之间分为不同聚类,存在明显的离散分组现象,表明3个组之间代谢物存在显著差异(浓度、数量、种类等).mix为质控样本,质控样本聚集在一起,表明检测过程稳定性好,数据可靠.

10M-OL:老叶;10M-ML:中叶;10M-YL:嫩叶;mix:质控样本

2.3.2 聚类分析

对代谢物在不同样本间的积累模式进行聚类分析,聚类结果见图4.由图4可知,各阶段的3个生物学重复之间代谢物的差异不大,但3个不同阶段组分之间的代谢物存在差异.嫩叶中的代谢物种类主要集中在黄酮醇、黄酮、橙黄酮、二氢黄酮等;老叶中的代谢物种类主要集中在查尔酮、橙黄酮、黄酮、黄酮醇等;中叶中的代谢物种类主要集中在二氢黄酮、异黄酮、花青素、黄酮碳糖苷等.

不同颜色为相对含量标准化处理后得到的数值(红色代表高含量,蓝色代表低含量);横轴为分组名,纵轴为代谢物名称

2.3.3 差异代谢物筛选

将老叶、中叶与嫩叶3个组分的黄酮类代谢物进行两两组间差异筛选,选取fold change ≥ 2和fold change ≤ 0.5,OPLS-DA模型的VIP(variable importance in projection)值大于等于1的代谢物.筛选结果显示中叶/老叶组筛选到54种差异代谢物:其中22种上调,即在老叶中相对含量较高,主要代谢产物类型为黄酮(11种)、黄酮醇(6种);另外32种代谢物表现为下调,即在中叶中相对含量较高,主要代谢产物类型为黄酮(17种)、黄酮醇类(10种).

嫩叶/中叶组筛选到50种差异代谢物:其中22种上调,即在中叶中相对含量较高,主要代谢产物类型为黄酮(16种)、黄酮醇(10种);另外28种代谢物表现为下调,即在嫩叶中相对含量较高.主要代谢产物类型为黄酮(17种)、黄酮醇(15种).

嫩叶/老叶组筛选到68个差异代谢物:其中29种上调,即在老叶中相对含量较高,主要代谢产物类型为黄酮(16种)、黄酮醇(10种);另外39种代谢物表现为下调,即在嫩叶中相对含量较高,主要代谢产物类型为黄酮(17种)、黄酮醇(15种).具体分布情况见图5和图6.

10M-ML/10M-OL:中叶/老叶组;10M-YL/10M-ML:嫩叶/中叶组;10M-YL/10M-OL:嫩叶/老叶组

(a)10M-ML/10M-OL中叶/老叶组;(b)10M-YL/10M-ML嫩叶/中叶组;(c)10M-YL/10M-OL嫩叶/老叶组不同颜色为相对含量标准化处理后得到的数值(红色代表高含量,蓝色代表低含量);横轴为分组名,纵轴为代谢物名称

通过韦恩图的形式,展示各组差异代谢物之间的关系.图7每个圈代表一个比较组,圈和圈重叠部分的数字代表比较组之间共有的差异代谢物个数,没有重叠部分的数字代表比较组特有的差异代谢物个数.韦恩图表明,与嫩叶、中叶的差异代谢物相比,老叶特有的差异代谢物较多.其中,3个不同生长阶段叶片共有的差异代谢物有12种,嫩叶/老叶组、中叶/老叶组、嫩叶/中叶组分别有68、54、50种差异代谢物.

10M-ML/10M-OL:中叶/老叶组;10M-YL/10M-ML:嫩叶/中叶组;10M-YL/10M-OL:嫩叶/老叶组

KEGG数据库有助于将基因、表达信息以及代谢物含量作为一个整体网络进行研究,将3个生长阶段检测到的差异代谢物进行KEGG富集,结果如图8.中叶/老叶组内的54种差异代谢物在黄酮和黄酮醇生物合成途径显著富集;嫩叶/中叶组内的50种差异代谢物在类黄酮生物合成途径显著富集;嫩叶/老叶组内的68种差异代谢物在黄酮和黄酮醇生物合成途径显著富集.

(a)中叶/老叶组;(b)嫩叶/中叶组;(c)嫩叶/老叶组

3 讨论与结论

青钱柳叶片中含有许多化学成分,由青钱柳叶制成的茶叶,黄酮类成分含量较高,有很好的保健疗效,因此存在较高的开发价值.黄酮类化合物的合成受到许多酶的调控,如苯丙氨酸解氨酶(PAL)、查尔酮合成酶(CHS)、黄酮合成酶(FLS)等[22].除此之外,环境因子,例如光照、水分、矿物质和温度等,均影响着黄酮类化合物的合成[23].植物处于不同地区或同一地区不同海拔,体内总黄酮含量存在差异;同一植株的不同营养器官总黄酮含量也存在差异[24-25].黄酮的积累还受氮源的影响,氮源影响初级代谢和次级代谢之间的碳流分配而进一步影响黄酮类化合物的生物合成,高氮施肥会减少植物体内类黄酮的积累[26-27].

黄酮含量的季节性变化也是其受外界气候影响的表现之一,根据不同的采摘时间和采摘叶龄可以提高叶片的利用率.本实验中,不同月份之间总黄酮含量也表现出差异性.4月青钱柳总黄酮含量最高,此时福建正处于春季,为青钱柳的生长期,当月温度适宜且雨水充足,有利于植物体内的各种酶作用使次生代谢物得到积累.Duncan多重比较结果表明,4月与5月之间总黄酮含量差异极显著(P<0.01),且与8、11月差异显著(P<0.05),但与6、9、10月无显著差异.总黄酮含量变化总体呈现降低-增加-降低的趋势.波动范围较大的原因可能为当地气温变化较大,且总黄酮含量低的月份处于雨季,高温闷热且潮湿的梅雨天气不利于次生代谢物积累.若以总黄酮为采收指标,4、7、10月可作为青钱柳叶片采收月份.

本研究结果表明,不同生长阶段的叶片中,黄酮类代谢物成分差异显著.将各组分间的差异代谢物表达情况进行对比,结果表明各组差异代谢物下调表达居多.总体来看,大多数代谢物在老叶的表达水平高于嫩叶和中叶,在中叶的表达水平高于嫩叶.分析各组差异代谢物发现,老叶具有特征性的代谢物为山奈酚-3-O-(4″-O-对香豆酰)鼠李糖苷和山奈酚-3-O-(3″-O-对香豆酰)鼠李糖苷等山奈酚糖苷类物质;中叶中,具有特征性的代谢物为矢车菊素-3-O-半乳糖苷和矢车菊素-3-O-葡萄糖苷等矢车菊素糖苷类物质;嫩叶中,特征代谢物主要集中在槲皮素-3-O-木糖苷和槲皮素-3-O-新橘皮糖苷等槲皮素糖苷类物质中.

根据KEGG富集图(图8)可知,老叶被注释的差异代谢物数量居多,且多富集在黄酮和黄酮醇生物合成途径,其中包含山奈酚在内的物质合成途径是老叶特有的代谢物合成途径.山奈酚被报道具有广泛的生物学活性,如清除自由基、抗炎、免疫抑制、抗病毒、抗肿瘤等作用[28-29],在治疗癌症、抗氧化等医疗方面和保健方面都有一定功效.因此,青钱柳叶黄酮类成分的开发无疑为天然药物市场提供了广阔的前景.本研究结果为青钱柳相关产品开发提供初步的理论指导,后期将进一步收集多年多点的数据,以进一步明确环境因素对上述差异性产生的影响.

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