基于HPA轴探讨二甲双胍对糖尿病合并抑郁症大鼠抑郁行为的影响

覃英梅，王 强，尹 玮，潘红丹

（广西国际壮医医院健康管理中心，南宁 530001）

二甲双胍是目前干预糖尿病的一线药物，不仅可降糖、减重，还能保护神经、抗衰老。二甲双胍可通过减少循环支链氨基酸减轻胰岛素抵抗小鼠的抗焦虑和抗抑郁样反应，提示其抗抑郁作用[1]。本研究通过建立糖尿病合并抑郁症大鼠模型，观察二甲双胍对其抑郁行为的影响，并探讨可能机制。

1 实验材料

1.1 实验动物

45只SD大鼠，SPF级，雄性，8周龄，体质量（320±20）g，购自北京百奥赛图基因生物技术有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK（京）2019-0001。

1.2 药物与试剂

盐酸二甲双胍片（国药准字H20123035，0.5 g，上海信谊药厂有限公司）；链脲佐菌素（streptozotocin，STZ），CAS（18883-66-4，成都贝斯特试剂有限公司）；皮质醇（cortisol，CORT）、促肾上腺皮质激素（adrenocorticotropic hormone，ACTH）放射免疫分析试剂盒；兔抗大鼠闭锁小带蛋白-1（zonula occludens-1，ZO-1）、IV型胶原蛋白（type IV collagen，CoIV）一抗（美国Thermo Fisher Scientific公司）。

1.3 仪器

大小鼠自发活动旷场实验装置（上海欣软信息科技有限公司）；Synergy-HD显微镜（日本东芝公司）；CheniDoc XRS凝胶成像分析系统（美国Biorad公司）。

2 实验方法

2.1 建立模型[2]

采用一次性腹腔注射STZ的方式建立糖尿病模型。大鼠腹腔注射STZ（采用pH为4.5的枸橼酸缓冲液配置为浓度80 g·L-1）65 mg·kg-1，给药后第1、5、10天后随机血糖＞16.70 mmol·L-1，且表现为体质量减轻、多尿为建模成功。糖尿病模型建立成功的大鼠采用慢性刺激法建立抑郁模型：每天随机从禁食24 h、禁水24 h、夹尾1 min、束缚3 h、4 ℃冰水游泳、45 ℃环境5 min、每分钟160次水平振荡30 min 7种刺激方式中随机选1种刺激大鼠，1周中7种刺激均进行1次，连续3周，以大鼠表现为主动性活动减少、兴趣缺失、食欲不振为建模成功。

2.2 分组与干预方式[3]

从45只大鼠中随机抽取10只仅注射等量枸橼酸缓冲液，设为对照组，其余35只建立糖尿病合并抑郁症模型，30只建模成功，随机分为模型组、实验A组、实验B组，各10只。实验A、B组腹腔注射二甲双胍生理盐水溶液1 mL，用药剂量分别为150 mg·kg-1、300 mg·kg-1，对照组、模型组腹腔注射等体积生理盐水。每天1次，连续干预4周。

2.3 旷场实验检测大鼠自发活动度[4]

末次干预后次日，采用旷场实验测试大鼠运动能力。在80 cm×120 cm×100 cm实验黑箱上方放置全方位摄像头，将大鼠置于中央，摄像头记录大鼠5 min内活动影像，计算大鼠总移动距离缩短、移动速度。每只实验后擦拭、消毒黑箱底面、内壁，避免气味残留对后续实验造成影响。实验前10 min将大鼠带入实验房间适应环境，期间保持房间安静。

2.4 糖水消耗实验检测大鼠糖水偏嗜度[5]

造模前训练大鼠逐渐适应糖水，末次干预后次日进行糖水消耗实验。第1天饲喂2瓶1%蔗糖水，第2天将其中1瓶糖水替换为去离子水，第3天禁食、禁水24 h，饲喂去离子水、蔗糖水各1瓶，每瓶100 mL，1 h后检测去离子水与蔗糖水消耗量（mL），计算糖水偏嗜度（%）=糖水消耗量÷液体总消耗量×100%。

2.5放射免疫分析法检测下丘脑-垂体-肾上腺轴（hypothalamic pituitary adrenal axis，HPA）轴活性[6]

糖水消耗实验完成后采集大鼠腹主动脉血2 mL，冰浴试管中静置30 min，每分钟3 000转离心10 min，取血清。采用放射免疫分析法检测血清CORT、ACTH水平，严格按照试剂盒说明书操作。

2.6 免疫印迹法检测海马组织ZO-1、CoIV蛋白表达[7]

采血后处死脱颈大鼠，剥离颅骨，迅速取出脑组织，根据《大鼠脑立体定位图谱》分离海马组织，分成2份，1份保存于液氮中，1份固定于4%多聚甲醛中，病理切片机切片（厚度5 μm）。取液氮保存海马组织，充分剪碎，匀浆，加入RIPA裂解液，转移至离心管，离心后定量蛋白。取50 μg样本，混合上样缓冲液混合，100℃金属浴5 min，离心取上清，电泳，湿转至硝酸纤维素膜，封闭2 h，加入兔抗大鼠ZO-1、CoIV一抗（1:500），4 ℃摇床孵育2 h，TBST洗膜，加入山羊抗兔IgG二抗（1:2 000），常温孵育2 h，TBST洗膜，发光液显色、曝光，凝胶成像系统分析，蛋白表达量以待测蛋白/内参GAPDH的灰度值表示。

2.7 HE染色观察海马组织病理变化[8]

取海马组织切片，二甲苯脱蜡，无水乙醇冲洗，自来水冲洗30 s，苏木精染液染色5 min，自来水冲洗，盐酸酒精分化，自来水冲洗，反蓝，伊红染液染色2 min，梯度乙醇脱水、透明，中性树胶封片，光学显微镜下观察海马CA1区病理变化。

2.8 统计学方法

统计、分析数据通过SPSS 19.0软件进行，以均数±标准差（±s）表示计量资料，采用单因素方差分析（One-Way ANOVA）比较多样本计量资料，以LSD-t检验进行两两比较。以P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 各组旷场实验结果比较

见表1。

表1 各组旷场实验结果比较（±s，n= 10）

表1 各组旷场实验结果比较（±s，n= 10）

注：与对照组比较，# P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05；与实验A组比较，▲P＜0.05

组别 剂量/（mg·kg-1）总移动距离 /cm 移动速度/（cm·s-1）对照组 0 1623.54±175.73 6.35±0.74模型组 0 832.14±95.43# 2.24±0.32#实验A组 150 1119.98±130.54△ 3.98±0.48△实验B组 300 1365.52±158.27▲ 5.06±0.65▲

3.2 各组糖水偏嗜度比较

见表2。

表2 各组糖水偏嗜度比较（±s，n= 10）

表2 各组糖水偏嗜度比较（±s，n= 10）

注：与对照组比较，# P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05；与实验A组比较，▲P＜0.05

组别 剂量/（mg·kg-1） 糖水偏嗜度/%对照组 0 82.51±8.96模型组 0 51.33±6.52#实验A组 150 62.32±7.49△实验B组 300 75.67±8.71▲

3.3 各组HPA轴活性比较

见表3。

表3 各组HPA轴活性比较（±s，n= 10）

表3 各组HPA轴活性比较（±s，n= 10）

注：与对照组比较，# P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05；与实验A组比较，▲P＜0.05

ACTH/（pg·mL-1）对照组 0 8.15±0.74 72.59±9.63模型组 0 14.96±2.31# 116.98±25.54#实验A组 150 11.52±2.46△ 102.52±12.47△实验B组 300 8.97±1.12▲ 89.63±11.20▲组别 剂量/（mg·kg-1）CORT/（ng·mL-1）

3.4 各组海马组织ZO-1、CoIV蛋白表达量比较

见表4、图1。

表4 各组海马组织ZO-1、CoIV蛋白表达量比较（±s，n= 10）

表4 各组海马组织ZO-1、CoIV蛋白表达量比较（±s，n= 10）

注：与对照组比较，# P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05；与实验A组比较，▲P＜0.05

组别 剂量/（mg·kg-1） ZO-1 CoIV对照组 0 0.96±0.14 0.14±0.02模型组 0 0.12±0.02# 1.15±0.17#实验A组 150 0.25±0.03△ 0.88±0.13△实验B组 300 0.87±0.09▲ 0.64±0.07▲

图 1 免疫印迹法检测各组海马组织ZO-1、CoIV蛋白表达

3.5 各组海马组织病理变化

HE染色结果显示，对照组海马CA1区神经元排列整齐、结构完整、形态规则、核仁清晰，具有明显的极性；模型组神经元肿胀或萎缩，溶解或碎裂，细胞层数减少，较多发生坏死，排列疏松；实验A、B组神经元数量有所增加，细胞排列较为紧密、层数增加，肿胀、萎缩、溶解、碎裂减少，其中实验B组改善效果优于实验A组。见图2。

图 2 各组苏木精—伊红染色后光学显微镜下海马CA1区病理学改变（×400）

4 讨论

ZO-1是一种高分子量磷蛋白，分布在上皮与血管内皮细胞，主要功能是紧密连接内皮细胞，其表达量高低与血脑屏障的关闭与开放密切相关[9]。CoIV主要分布在血脑屏障基底膜的透明层，可结合层黏连蛋白构成基底膜骨架。研究发现，高血糖可诱导层黏连蛋白、CoIV合成，导致毛细血管基底膜厚度增加。二甲双胍属于双胍类口服降血糖药，可延缓胃肠道摄取葡萄糖，并增强机体对胰岛素的敏感性从而提高外周葡萄糖利用效率，降低血糖。此次，二甲双胍被食品药品监督管理局认为是神经再生、优化的药物，可促进神经干细胞的增殖与分化，从而保护神经功能。二甲双胍可改善脂多糖诱导的抑郁小鼠抑郁样行为并纠正异常的谷氨酸能传递[10]。本研究结果显示，与模型组比较，实验A组总移动距离延长，移动速度加快，糖水偏嗜度、ZO-1蛋白表达量升高，CoIV蛋白表达量降低，且实验B组效果优于实验A组，提示二甲双胍可改善糖尿病并发抑郁症大鼠抑郁样行为，减轻血脑屏障损伤。

HPA轴是由下丘脑、垂体及肾上腺构成的反馈调节系统，三者互相协调，形成神经内分泌免疫网络枢纽，通过对外界刺激做出心理与生理反应维持机体内环境稳定[11]。HPA轴功能亢进是抑郁症的主要发病机制之一，机体长期处于应激状态，下丘脑释放大量促肾上腺皮质激素释放激素，诱导垂体合成并释放大量ACTH，作用于肾上腺皮质，刺激肾上腺皮质与外周血中CORT水平升高。HPA轴功能的改变是抑郁症发生及认知恶化的一种可能机制，抑郁症与较高的CORT、ACTH水平有关[12]。本研究结果显示，与模型组比较，实验A组血清CORT、ACTH水平降低，且实验B组效果优于实验A组，提示二甲双胍对糖尿病并发抑郁症大鼠的治疗作用可能通过抑制HPA轴活性来实现。