葛根多糖对健康犊牛基础临床指标、生理生化指标及血浆代谢物的影响

2022-11-15吕尚揆尤留超苏柘僮曹随忠余树民沈留红

动物营养学报 2022年10期

莘余吕尚揆* 尤留超樊磊张琼苏柘僮曹随忠余树民沈留红**

(1.四川农业大学动物医学院，动物疫病与人类健康四川省重点实验室，奶牛疾病研究中心，成都 611130；2.广西英路维特药物有限公司，荔浦 546600)

犊牛生长发育和健康状况直接影响其生产性能，关乎养牛业的发展，但断奶前犊牛机体抵抗力弱，易受外界刺激而发生疾病[1]。因此，增强犊牛抵抗力，降低发病率，提高其生产性能，一直是养牛业追求的目标。抗生素可有效保障动物健康，但所造成的药物残留以及危害公众健康等问题不容忽视。在养殖业减抗、禁抗背景下，寻求天然、无抗、无残留、促生长的饲料添加剂具有重要意义[2]。多糖类、多酚类、皂苷类和氨基酸类[3]等天然植物提取物具有提高动物机体抗氧化活性[4]、促进肠道发育、增强机体免疫等作用[5]，进而改善其生长性能，被广泛应用于动物生产[6-7]。研究表明，酵母多糖可促进犊牛的生长发育和营养物质的消化吸收[8]；枸杞多糖可显著增强肉牛机体抗氧化能力，提高平均日增重[9]；植物水解单宁可有效提高秦川牛对蛋白质吸收能力，增强免疫力，改善瘤胃微生物区系[10]。葛根多糖作为葛根天然成分，具有抗氧化[11]、抗菌[12]和调节免疫[13]等作用，可恢复结肠炎小鼠受损紧密连接蛋白表达水平和结构，恢复肠道屏障功能[14]，还可上调腹泻小鼠肠道有益菌水平，改善菌群结构[15]。目前，葛根多糖在犊牛上的应用鲜有报导。因此，本研究旨在探究葛根多糖对健康犊牛基础临床、生理生化指标及血浆代谢物的影响，为其在犊牛生产中的应用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本试验所用葛根多糖(纯度50.00%，平均分子质量1.09×105u)由广西某药物有限公司提供。

1.2 试验动物与试验设计

选择四川某规模化牧场临床检查健康，年龄[(6.20±3.65) d]和体重[(47.09±4.50) kg]相近的荷斯坦犊牛24头，随机分为对照组(C组)和试验组(E组)，每组12头。参考相关文献[16]并经预试验(每天每头牛在牛奶中添加200、400、800 mg/kg葛根多糖，连续5 d，观察至21 d，期间犊牛腹泻率分别为1.19%、0、0)确定，E组每天每头牛在牛奶中添加400 mg/kg葛根多糖，C组不添加。连续饲喂5 d，并持续观察21 d。为确保全量摄入，先将葛根多糖溶于少量牛奶，待犊牛吃完后再饲喂剩余部分牛奶。

1.3 饲养管理

所有犊牛单笼饲养，出生后称重，30～120 min内饲喂初乳4 L，3日龄提供自由饮水，7日龄提供干草和犊牛开食料；3周龄内，饲喂常乳2次/d，每次4 L。定期清理消毒，所有试验犊牛均无既往病史和用药史。犊牛开食料营养水平见表1。

表1 犊牛开食料营养水平(干物质基础)Table 1 Nutrient levels of calves starter (DM basis) %

1.4 样品采集及指标测定

1.4.1 基础临床指标测定

每日饲喂前测定试验第1～7天各组犊牛直肠温度、心率、呼吸频率。

1.4.2 体重及腹泻率测定

试验开始前、第7天、第14天和第21天对犊牛体重进行测定，统计腹泻犊牛数并计算腹泻率，计算公式如下：

腹泻率(%)=100×(总腹泻头数×总腹泻天数)/(总头数×试验天数)。

1.4.3 血液样品采集及处理

在试验第1天、第3天、第5天和第7天饲喂前分别采集各试验犊牛颈静脉血，添加乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝，获得犊牛血浆样品；无抗凝血样室温静置1 h，3 000 r/min离心5 min，获得犊牛血清样品。部分第7天血浆样品置于-80 ℃保存，用于后续血浆代谢物检测与分析。

1.4.4 血常规及血清生化指标检测

分别使用IDEXX Procyte Dx全自动五分类血细胞分析仪和斯马特全自动生化分析仪检测各组犊牛第1天、第3天、第5天和第7天血常规指标和血清生化指标。

1.4.5 血浆代谢物检测与分析

将-80 ℃的血浆样品复融，吸取适量样本加入预冷甲醇/乙腈/水溶液(2∶2∶1，体积比)，涡旋混匀，超声30 min(冰水浴)，-20 ℃静置10 min，4 ℃、12 000 r/min离心15 min，吸取上清液，采用Agilent 1 290 Infinity LC超高效液相色谱仪进行物质分离，在AB 6 600 Triple TOF质谱仪下基于IDA采集模式进行一级、二级质谱数据的采集。采集条件如下：轰击能量为(35±15) ev，每50 ms采集15张二级谱图。电喷雾离子源(ESI)参数设置如下：雾化气压(GSI)、辅助气压及气帘气压分别为60、60、30 psi；温度为600 ℃，喷雾电压为5 500 V(正离子模式)和-5 500 V(负离子模式)。

使用ProteoWizard软件将原始质谱转成mzXML格式，XCMS保留时间矫正、峰识别、峰提取、峰积分、峰对齐等工作，并使用二级质谱数据库对峰进行物质鉴定。然后进行正交偏最小二乘法-判别分析(OPLS-DA)，获得变量重要性投影(VIP)。差异代谢物筛选条件为变异倍数(FC)>1.5或FC<0.67，VIP>1和P<0.05。将筛选到的差异代谢物导入KEGG数据库，注释到差异代谢物相关的代谢通路，最后通过MetaboAnalyst 5.0在线数据库进行通路富集分析。

1.5 数据统计分析

采用SPSS 27.0统计软件进行单因素方差分析和LSD法多重比较，统计结果用平均值±标准差表示，以P<0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 葛根多糖对健康犊牛基础临床指标的影响

由表2可知，试验第1～7天，C组与E组之间犊牛体温、心率和呼吸频率均无显著差异(P>0.05)。

表2 葛根多糖对健康犊牛基础临床指标的影响Table 2 Effects of Pueraria polysaccharides on basic clinical indices of healthy calves

2.2 葛根多糖对犊牛体重和腹泻率的影响

由表3可知，试验第1～7天、第8～14天、第15～21天，C组与E组之间犊牛体重无显著差异(P>0.05)，但各时间段E组犊牛体重均高于C组。这说明饲喂葛根多糖对犊牛后续生长具有一定的促进作用。

由表4可知，试验第1～7天，C组和E组犊牛无腹泻。试验第8～21天，C组有3头犊牛腹泻，腹泻率为5.36%；E组犊牛无腹泻，腹泻率为0。这说明葛根多糖具有预防犊牛腹泻的作用。

表3 葛根多糖对健康犊牛体重的影响Table 3 Effects of Pueraria polysaccharides on body weight of healthy calves kg

表4 葛根多糖对健康犊牛腹泻率的影响Table 4 Effects of Pueraria polysaccharides on diarrhea rate of healthy calves

2.3 葛根多糖对健康犊牛血常规指标的影响

由表5可知，C组与E组之间犊牛血常规指标均无显著差异(P>0.05)。这说明添加400 mg/kg葛根多糖对犊牛血常规指标无明显影响。

表5 葛根多糖对健康犊牛血常规指标的影响Table 5 Effects of Pueraria polysaccharides on blood routine indices of healthy calves

2.4 葛根多糖对健康犊牛血清生化指标的影响

由表6可知，C组与E组之间犊牛血清生化指标均无显著差异(P>0.05)。这说明添加400 mg/kg葛根多糖对犊牛血清生化指标无明显影响。

2.5 代谢组学的多元统计分析

使用有监督的模式识别方法OPLS-DA对数据模型可靠性进行分析。如图1-A所示，在正离子模式下R2Y=0.775；如图1-B所示，在负离子模式下R2Y=0.90，表明模型建立较好，所获得的数据可用于进一步分析。采用置换检验对模型进行过拟合检验，图1-C、图1-D显示了在正负离子模式下，模型的R2和Q2均逐渐下降，说明原模型不存在过拟合现象，模型稳定性良好。

2.6 血浆差异代谢物分析

在正、负离子模式下，共检测到14种差异代谢物。由表7可知，血浆溶血磷脂酰胆碱18∶0、胆绿素等10种代谢物丰度显著下调(P<0.05)，血浆二酰甘油、瓜氨酸、N-乙酰腐胺和次黄嘌呤4种代谢物丰度显著上调(P<0.05)。对血浆差异代谢物进行分类，发现共涉及苯类、二肽、脂质、脂质和类脂分子、有机酸及其衍生物、有机化合物、有机氧化合物、有机杂环化合物和未分类代谢物(图2-A)。进一步筛选出葛根多糖影响健康犊牛的关键血浆代谢物，即二酰甘油、次黄嘌呤、瓜氨酸和溶血磷脂酰胆碱18∶0(图2-B)。

表6 葛根多糖对健康犊牛血清生化指标的影响Table 6 Effects of Pueraria polysaccharides on serum biochemical indices of healthy calves

2.7 血浆差异代谢物途径分析

利用Metaboanalyst通路富集分析功能，对血浆差异代谢物进行通路富集分析。如图3所示，上述差异代谢物共涉及精氨酸和脯氨酸代谢，精氨酸生物合成，卟啉代谢，甘氨酸、苏氨酸和丝氨酸代谢，甘油磷酸脂代谢和嘌呤代谢6条代谢通路。与饲喂葛根多糖的健康犊牛血浆代谢物改变最为相关的是精氨酸和脯氨酸代谢(P<0.05)。

3 讨论

3.1 葛根多糖对健康犊牛主要临床指标、血常规和血清生化指标的影响

体温、心率和呼吸频率等临床指标常用于评估机体健康[17]，血常规和血清生化指标同样也被普遍用于评价动物健康状况，其中血常规指标是衡量机体生理健康状态和疾病严重程度的重要依据[18]，丙氨酸氨基转移酶(ALT)、碱性磷酸酶(ALP)均是反映肝脏功能的可靠指标[19]，肌酐(CREA)和尿素氮(UN)是反映蛋白质代谢和肾功能的重要指标[20]，球蛋白包含大量炎症反应蛋白，与机体炎症状态密切相关[21]。本试验中，试验组犊牛连续5 d饲喂葛根多糖，体温、心率、呼吸频率较对照组犊牛无显著变化。结合血常规和血清生化指标检测结果发现，葛根多糖同样也没有对试验犊牛产生显著影响。由此可见，每天每头牛在牛奶中添加400 mg/kg葛根多糖对健康犊牛无明显临床副作用。

3.2 葛根多糖对健康犊牛血浆代谢物的影响

多糖通过调节机体代谢发挥抗氧化，降低炎症反应等作用[22-24]。本研究中，健康犊牛饲喂葛根多糖后血浆二酰甘油、瓜氨酸和次黄嘌呤等丰度显著升高。研究表明，二酰甘油可抑制胆汁酸的分泌，并参与氧化应激下肠道损伤的修复，用于治疗腹泻[25]。此外，二酰甘油还是多种信号分子的有效激活剂，是维持细胞间信息传递的关键物质[26]。二酰甘油参与了犊牛机体多种信号调节，其丰度的增加有利于健康犊牛生长发育。瓜氨酸是一种非必需氨基酸，在精氨酸琥珀酸裂解酶催化下转化为精氨酸[27]。本试验发现，牛奶中添加葛根多糖上调了瓜氨酸参与的精氨酸生物合成通路，而精氨酸作为新生犊牛生长过程中的一种条件性必需氨基酸[28]，除在蛋白质合成中起作用外，还是一氧化氮(NO)和多胺合成的常见底物，从而满足肠道细胞增殖的关键调控作用[29]，且研究表明精氨酸具有促进犊牛肠道发育的作用[30]。虽然在检测到的差异代谢物中并没有精氨酸，但饲喂葛根多糖后上调了瓜氨酸的水平及其参与的精氨酸生物合成通路。并且，在试验第8～21天，对照组犊牛有3头发生了腹泻，而试验组犊牛在试验期间未发生腹泻。由此可推断，葛根多糖可能通过促进健康犊牛肠道发育，从而预防了犊牛腹泻。而次黄嘌呤可调节肠道上皮细胞能量代谢，改善肠道屏障功能并促进伤口愈合[31]。通过以上结果表明，葛根多糖具有提高机体抗氧化能力、促进肠道发育的作用，从而防止犊牛腹泻。

A、C为正离子模式下所得结果，B、D为负离子模式下所得结果。A and C were the result from ESI+, and B and D were the result from ESI-.图1 OPLS-DA得分图Fig.1 OPLS-DA scores graphs

表7 2组之间血浆差异代谢物Table 7 Plasma differential metabolites between two groups

续表7项目Items变量投影重量度VIPP值P-value差异倍数FC趋势TrendN-乙酰腐胺N-acetylputrescine1.00<0.051.65↑肌酐Creatinine4.35<0.050.73↓N1,N12-二乙酰精胺N1,N12-diacetylspermine1.64<0.050.54↓L-山梨糖L-sorbose1.28<0.010.55↓次黄嘌呤Hypoxanthine2.26<0.056.34↑胆绿素Biliverdin1.33<0.050.37↓1-甲基假尿苷1-methylpseudouridine1.28<0.010.39↓

*代表差异显著(P<0.05)。* mean significant difference (P<0.05).图2 2组血浆差异代谢物FC值柱状图(A)和关键代谢物的log10峰值图(B)Fig.2 FC value histogram of plasma differential metabolites (A) and key metabolite peaks figure of log10 (B) between 2 groups

此外，健康犊牛饲喂葛根多糖后溶血磷脂酰胆碱18∶0等差异代谢物下调。溶血磷脂酰胆碱是由细胞膜衍生的磷脂酰胆碱产生，具有调节免疫功能的作用[32]。体现为溶血磷脂酰胆碱促进单核细胞趋化增强，并激活巨噬细胞[33]等。相关研究表明，发生围产期疾病的奶牛血浆代谢物中常出现溶血磷脂酰胆碱水平升高[34]。溶血磷脂酰胆碱18∶0水平显著下调提示葛根多糖在调节健康犊牛免疫反应方面发挥作用。在哺乳动物中，胆绿素通过胆绿素还原酶还原为胆红素[35]。胆红素是一种抗氧化剂，具有清除活性氧作用，以保护细胞免受氧化损伤[36]。饲喂葛根多糖后胆绿素显著下调，推测可能是葛根多糖促进了胆绿素还原为胆红素，以增强健康犊牛机体的抗氧化能力。肌酸是一种含氮的有机酸，在肝脏、肾脏中由精氨酸、甲硫氨酸和甘氨酸合成[37]。肌酸通过肌酸-磷酸肌酸系统，在肌酸激酶的催化下转化为磷酸肌酸，为机体功能[38]。肌酸水平下调，表明葛根多糖可促进犊牛生长，增加犊牛机体的能量需求，从而加速肌酸代谢。而肌酐由肌肉组织中的肌酸及磷酸肌酸代谢而来[39]，随肌酸减少同样出现了下调趋势。本试验中，犊牛体重虽无显著差异，但葛根多糖对健康犊牛体重升高的趋势高于对照组，推测可能是由于饲喂葛根多糖的时间较短所致。后续可通过增加饲喂天数来探究葛根多糖对健康犊牛生产性能的影响。

x轴为富集系数，y轴为P值，圆圈代表代谢通路，圆圈颜色深浅表示代谢物通路中代谢物显著性变化，圆圈大小与代谢物数相对应。The x axis is the rich factor, the y axis is P-value. The circle represents the metabolic pathway, the color depth of the circle indicates a significant change in metabolic pathway, and the circle size corresponds metabolites number.图3 血浆差异代谢物KEGG通路分析Fig.3 KEGG pathway analysis of plasma differential metabolites