良验益真咀嚼片高效液相色谱指纹图谱的建立及4种成分的含量测定

2022-11-15马群姚东胡北许子华北部战区总医院沈阳110000

中南药学 2022年9期

马群，姚东，胡北，许子华（北部战区总医院，沈阳 110000）

我国寒区面积广阔，涵盖东北、西北、华北，约占我国陆地面积的43.5%。我国东、北、西分别与朝鲜、俄罗斯、蒙古、巴基斯坦、印度接壤，边境线长，是国防战略要地。北部战区所辖的东北地区冬季寒冷期长、气温极低、气候条件恶劣，这种极端环境给官兵在户外训练、执行任务带来了极大困难[1]。为了解决上述困难，本课题组依据中医学理论，利用中药“治未病”的特色优势，将寒冷损伤的医学干预前移，寻找具有机体产热作用、能够抵御寒冷、在寒冷环境下能够维持机体正常生理机能的有效中药方剂[2]。课题组通过网络药理学及分子对接等药物虚拟筛选技术[3]，选取了中医经典理论中具有温里散寒之功的良验益真方。此方源自唐代中医古籍《元和纪用经》中的良验益真散，由黄芪和肉桂两味药材组成，具有补火散寒、温肾之功效，及防治冻伤、促进机体产热之作用。方中以黄芪健脾益气，使清气升，精血得摄；以肉桂补火助阳，散寒；黄芪和肉桂先、后天互补，可使血止而真气得复。黄芪和肉桂的药效在既往的药理学研究中也得到了验证[4-6]。在前期研究确证其具有产热功效的基础上，课题组经过系统深入的药效、安全性、质量控制和制备工艺研究，结合现代中药制剂的研究技术及各剂型的特点，以甘露醇、糊精作为辅料，研制开发了基于机体产热作用的提升寒区适应能力和战斗效能、预防寒冷损伤的北部战区总医院院内制剂——良验益真咀嚼片。本制剂服用运携方便、质量稳定，在冷暴露前后服用，可提高人体核心体温，促进肢端能力的恢复。

中药指纹图谱作为衡量制剂质量的重要依据[7-8]，是一种综合的、宏观的、可量化的手段，可反映中药化学成分的整体组成和特征。为保证良验益真咀嚼片的质量，本研究按照中药指纹图谱研究的技术要求[9-10]，建立了该制剂的HPLC指纹图谱，同时测定了制剂中毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷、芒柄花素及桂皮醛4 种成分的含量，为良验益真咀嚼片的质量标准建立提供参考。

1 材料

1.1 仪器

LC-16 系列高效液相色谱仪（配有SPD-16 型紫外检测器、LC-16 型二元泵、SIL-16 型自动进样器、CTO-16 型柱温箱）（日本Shimadzu 公司）；AUW 120D 十万分之一分析天平（日本Shimadzu公司）；KQ3200 型超声波清洗器（昆山超声仪器有限公司，150 W，40 kHz）。

1.2 试药

良验益真咀嚼片[规格：每片重0.55 g（相当于饮片0.51 g），批号：20210607、20210608、20210609、20210610、20210611、20210615、20210617、20210621、20210623、20210628、20210701、20210705，北部战区总医院制剂研发室制备]；黄芪、肉桂[九洲恒源（安国）药业有限公司]；甲醇、乙腈（色谱级，Sigma Aldrich，USA）；甲酸（分析纯，天津市永大化学试剂有限公司）；超纯水（北部战区总医院制剂室）。

毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品（批号：wkq 21010405，纯度≥98%）、芒柄花素对照品（批号：wkq20062208，纯度≥98%）、芒柄花苷对照品（批号：wkq19070106，纯度≥98%）、毛蕊异黄酮对照品（批号：wkq20100906，纯度≥98%）（四川维克奇生物科技有限公司），肉桂酸对照品（批号：110786-200503，纯度：98.8%）、桂皮醛对照品（批号：110710-202022，纯度：99.5%）（中国食品药品检定研究院）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱为Phenomenex Luna 5u C18（2）100A（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为0.2%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脱方案见表1；流速0.8 mL·min－1；检测波长290 nm；柱温30 ℃；进样量10 μL。

表1 梯度洗脱方案Tab 1 Gradient elution

2.2 溶液的制备

2.2.1 混合对照品溶液的制备取各对照品适量，精密称定，置于棕色量瓶中，加入适量甲醇溶解，后用甲醇定容至刻度，作为各对照品储备液。精密量取适量各对照品储备液，加甲醇制成每1 mL 分别含有毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花素、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、肉桂酸、桂皮醛80、80、150、20、10、10 μg 的溶液，即得混合对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备将良验益真咀嚼片研磨成细粉，取5 g，精密称定置于具塞锥形瓶中，加入25 mL 甲醇，称重，超声20 min，放冷后甲醇补重，摇匀后静置10 min，取上清液，0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液即得。

2.2.3 单味药供试品溶液的制备按照良验益真咀嚼片制法中的药材提取工艺分别制备黄芪、肉桂单味药的提取浓缩液，各精密吸取1 mL 置于10 mL 量瓶中，使用甲醇定容后摇匀，0.45 μm 微孔滤膜过滤，取续滤液得到单味药供试品溶液。

2.3 指纹图谱方法学考察

2.3.1 精密度考察取良验益真咀嚼片样品（批号：20210615，S6），按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，连续进样6 次。以毛蕊异黄酮葡萄糖苷为参照峰，计算得各共有峰的相对保留时间RSD＜0.71%，相对峰面积RSD＜2.7%，表明仪器精密度良好。

2.3.2 稳定性考察取良验益真咀嚼片样品（S6），按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，于0、2、6、12、24、48 h 进样测定。以毛蕊异黄酮葡萄糖苷为参照峰，计算得其他各共有峰的相对保留时间RSD＜0.59%，相对峰面积RSD＜2.4%，表明供试品溶液在48 h 内稳定性良好。

2.3.3 重复性考察取良验益真咀嚼片样品（S6），按“2.2.2”项下方法平行制备6 份供试品溶液，进样测定。以毛蕊异黄酮葡萄糖苷为参照峰，计算得其他各共有峰的相对保留时间RSD＜0.24%，相对峰面积RSD＜2.8%，表明方法重复性良好。

2.4 良验益真咀嚼片HPLC 指纹图谱研究

2.4.1 指纹图谱的构建取12 批良验益真咀嚼片（S1 ～S12），按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，进样测定，记录色谱图。将色谱图导入中国药典委员会开发的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2012A 版）软件进行分析，选择S6作为参照图谱，以平均数法生成对照图谱，时间窗宽度为0.1 min，经多点校正、Mark 峰匹配、自动匹配后生成对照指纹图谱[11-13]，见图1。以峰面积较大、对称性较好的2 号峰（毛蕊异黄酮葡萄糖苷）作为参照峰，计算得其他各共有峰的相对保留时间和相对峰面积，结果见表2、3。

表2 12 批良验益真咀嚼片共有峰的相对保留时间Tab 2 Relative retention time of common peaks of 12 batches of Liangyan Yizhen chewable tablets

图1 12 批次良验益真咀嚼片指纹图谱（S1 ～S12）及其对照指纹图谱（R）Fig 1 Fingerprints of 12 batches of Liangyan Yizhen chewable tablets（S1 ～S12）and control（R）

2.4.2 共有峰的归属与指认分别取“2.2.3”项下单味药供试品溶液和“2.2.1”项下混合对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样分析，确认共有13 个共有峰，结果如图2 所示。经对照品保留时间定位及色谱峰分析，共指认出6 个特征峰，2 号峰为毛蕊异黄酮葡萄糖苷、6 号峰为芒柄花苷、8 号峰为毛蕊异黄酮、9 号峰为肉桂酸、10号峰为桂皮醛、12 号峰为芒柄花素。其中，1 ～8号、11 ～13 号峰来源于黄芪，9、10 号峰来源于肉桂。

图2 良验益真咀嚼片共有峰归属Fig 2 Common peak attribution of Liangyan Yizhen chewable tablets

2.4.3 指纹图谱相似度评价将12 批良验益真咀嚼片（S1 ～S12）指纹图谱导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2012A 版），生成对照指纹图谱并计算相似度，见表4。结果显示12 批良验益真咀嚼片样品相似度均大于0.9，说明良验益真咀嚼片批次间一致性良好。

表4 12 批良验益真咀嚼片指纹图谱相似度结果Tab 4 Fingerprint similarity of 12 batches of Liangyan Yizhen chewable tablets

2.5 4 种成分含量测定

2.5.1 专属性考察取“2.2.1”项下毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷、桂皮醛、芒柄花素对照品储备液适量，使用甲醇配制成每1 mL 分别含有毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷、桂皮醛、芒柄花素80、150、10、80 μg 的混合对照品溶液。取混合对照品溶液和供试品溶液，分别进样分析，结果显示供试品溶液的色谱图中4 种待测组分色谱峰保留时间与混合对照品溶液一致，且分离度均大于1.5，结果见图3。

图3 良验益真咀嚼片的HPLC 色谱图Fig 3 HPLC chromatogram of Liangyan Yizhen chewable tablets

表3 12 批良验益真咀嚼片共有峰的相对峰面积Tab 3 Relative peak areas of common peaks of 12 batches of Liangyan Yizhen chewable tablets

2.5.2 线性关系考察精密量取“2.2.1”项下毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷、桂皮醛、芒柄花素对照品储备液适量，用甲醇配制成一系列浓度的混合对照品溶液。精密吸取上述浓度的混合对照品溶液各10 μL，注入液相色谱仪测定，以对照品的质量浓度（μg·mL－1）为横坐标，峰面积值为纵坐标，求得回归方程，结果见表5。

表5 4 种成分线性关系Tab 5 Linearity of 4 constituents

2.5.3 精密度试验取“2.5.1”中浓度的混合对照品溶液，进样测定6 次，记录各成分的峰面积，计算得到毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷、桂皮醛、芒柄花素峰面积的RSD分别为1.9%、2.1%、2.2%、1.7%，结果表明该仪器精密度良好。

2.5.4 稳定性试验取良验益真咀嚼片（S6），按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，于0、2、6、12、24、48 h 进行测定，计算得到毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷、桂皮醛、芒柄花素峰面积的RSD分别为0.72%、1.9%、1.7%、2.0%，表明供试品溶液在48 h 内稳定性良好。

2.5.5 重复性试验取同一批良验益真咀嚼片（S6），按“2.2.2”项下方法平行制备6 份供试品溶液，进样测定，计算得到毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷、桂皮醛、芒柄花素的平均含量分别为0.3525、0.4038、0.0327、0.1945 mg·g－1，RSD分别为0.54%、0.84%、0.97%、1.9%，表明该方法重复性良好。

2.5.6 加样回收试验取已知成分含量的良验益真咀嚼片（S6），研成细粉，取2.5 g，共6 份，精密称定，分别精密加入毛蕊异黄酮葡萄糖苷溶液（0.3916 mg·mL－1）2.2 mL、芒柄花苷溶液（0.294 mg·mL－1）3.4 mL、桂皮醛溶液（0.4199 mg·mL－1）0.2 mL、芒柄花素溶液（0.4028 mg·mL－1）1.2 mL，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，进样测定，计算得到毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷、桂皮醛、芒柄花素的平均加样回收率分别为103.71%、102.33%、101.49%、101.51%，RSD分别为1.8%、1.8%、2.8%、2.9%，表明该方法准确性良好。

2.5.7 样品含量测定取各批次良验益真咀嚼片，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，进样测定，计算样品中毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷、桂皮醛、芒柄花素4 种成分的含量，结果见表6。

表6 12 批样品中4 种成分含量测定结果(mg·g－1，n ＝2)Tab 6 Content determination of 4 constituents in 12 batches of sample (mg·g－1，n ＝2)

3 讨论

3.1 定量指标的选择

本研究使用对照品指认出毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花素、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、肉桂酸、桂皮醛6 个成分。其中毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花素、芒柄花苷、毛蕊异黄酮来自黄芪，毛蕊异黄酮葡萄糖苷是药典中黄芪的指标性成分；肉桂酸、桂皮醛来自肉桂，桂皮醛是药典中肉桂的指标性成分[14]。毛蕊异黄酮与肉桂酸的色谱峰相邻，由于二者色谱峰的分离度不佳，不能满足定量要求，因此未对其定量。综上所述，选择了毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花素、芒柄花苷、桂皮醛作为该制剂的定量指标，涵盖了黄芪和肉桂两味药材的指标性成分。

3.2 色谱条件的考察

在确定检测波长的试验中，对毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、肉桂酸、桂皮醛、芒柄花素对照品的甲醇溶液进行了全波长扫描，发现它们的最大吸收波长分别为260、302、220、270、290、248 nm[15-16]，通过多波长扫描试验，最终选定波长为290 nm，在此波长下，良验益真咀嚼片中的6 个主要成分均有较好的紫外吸收，同时杂质对色谱峰的干扰较小。其他色谱条件优化试验中，主要考察的是流动相种类（乙腈、甲醇）、添加剂的种类（0.1%磷酸、0.3%磷酸、0.1%甲酸、0.2%甲酸）、流速、梯度洗脱比例等方面[15-16]。通过预试验，发现流动相的种类、流速、梯度洗脱比例对色谱峰的分离情况影响较大，添加剂的种类与浓度对色谱峰的峰形有一定影响，最终选定流动相为0.2%甲酸水溶液-乙腈进行梯度洗脱，各主要成分均能较好的分离，色谱行为较好。最终确定的色谱条件实现了指纹图谱的建立和多成分含量的同时测定。