杯苋甾酮通过拟雌激素样作用抑制破骨细胞分化

谢景春，赵玥，黄立慧，程禄萍，金奇，谢保平*（.于都县人民医院烧伤整形外科，江西 赣州99；.赣南医学院心脑血管疾病防治教育部重点实验室，江西 赣州 000；.赣南医学院第一附属医院信息科，江西赣州 000；.赣南医学院科研处，江西 赣州 000）

骨质疏松症（osteoporosis，OP）是骨骼代谢失衡导致的疾病，其特征是骨量减少和骨组织微结构破坏，导致骨密度下降，骨脆性和骨折发生概率升高[1-2]。破骨细胞和成骨细胞功能失衡是OP的重要发病机制，其中破骨细胞是机体内唯一具有骨吸收功能的多核巨噬细胞。因此，破骨细胞常被作为抗OP 药物研发和机制研究的靶细胞[3]。

雌激素受体（estrogen receptor，ER）是雌激素和植物雌激素（phytoestrogen，PE）抗骨质疏松作用的主要靶点，特别是ERα。李伟娟等[4]报道淫羊藿苷通过ERα/RANK 信号通路抑制RANKL 诱导的RAW264.7 细胞向破骨细胞分化和骨吸收功能。Xie 等[5]研究发现齐墩果酸上调ERα的表达，并通过ERα/miR-503/RANK 通路抑制破骨细胞分化和骨吸收功能。提示ERα信号通路在破骨细胞分化和抗OP 中扮演了重要的角色。

杯苋甾酮（结构见图1）是川牛膝中抗OP 的有效成分之一，有研究表明杯苋甾酮可显著增加去卵巢SD 大鼠胫骨的骨密度和最大应力[6]。纪亲龙等[7]研究显示，杯苋甾酮能显著抑制M-CSF 和RANKL 诱导的小鼠源性单核巨噬细胞（BMMs）向破骨细胞分化。然而，未见杯苋甾酮抑制破骨细胞分化和抗OP 的机制研究，特别是在ER 信号通路上的研究。因此，本研究拟用MCF-7 细胞证实杯苋甾酮的拟雌激素样作用，并用ER 竞争性阻断剂ICI 阻断ER，用TRAP 染色、qRT-PCR、Western blot 和分子对接等方法证实杯苋甾酮通过ER 信号通路抑制破骨细胞分化的机制，为杯苋甾酮抗OP 的临床应用提供参考。

图1 杯苋甾酮化学结构式Fig 1 Chemical structure of cyasterone

1 材料

1.1 仪器

Varioskan Lux 型酶标仪、ABI7500 型聚合酶链式反应（PCR）仪、240i 型培养箱、ST-16R 型离心机（Thermo Fisher Scientific 公司），HWS12型恒温水浴锅（上海一恒），EVOSFLCORE 型倒置显微镜（Life Technologies 公司），TS-1 型水平脱色摇床、Vortex-6 型旋涡混合器（江苏其林贝尔），UVP/Chemstudio 型多功能化学发光成像系统（Analytik Jena AG 公司），Trans-Blot 蛋白转印系统（Bio-Rad 公司）。

1.2 试药

杯苋甾酮对照品（成都曼思特生物科技有限公司，批号：A0699-20 mg，纯度≥98.83%）；ICI182780（Selleckchem 公司，批号：S119117，纯度≥99%）；TRizol 提取试剂（Life Technology公司）；逆转录试剂盒（Thermo Fisher Scientific公司，批号：00592018）；ERα抗体和GAPDH抗体（武汉三鹰生物技术有限公司，货号分别为21244-1-AP 和10494-1-AP）；DMEM 高糖培养基（上海中乔新舟生物技术有限公司）；RANKL 诱导因子（PEPROTECH 公司，批号：0815612）；αMEM 完全培养基和无酚红αMEM 培养基（武汉普诺赛生命科技有限公司）；青霉素和链霉素（北京索莱宝科技有限公司）；CCK-8 试剂（Biosharp生物科技有限公司）；TRAP 染色试剂盒（Sigma公司）；碳吸附胎牛血清（上海传秋生物，HTFBS-500）；NovoStart® SYBR Green Color qPCR Super Mix（Novoprotein 公司，批号：0513471）。

1.3 细胞

小鼠白血病巨噬细胞RAW264.7（上海中乔新舟生物技术有限公司）和人乳腺癌细胞MCF-7（武汉普诺赛生命科技有限公司）。

2 方法

2.1 细胞培养

RAW264.7 细胞培养于含10% FBS 和1%青霉素/链霉素的DMEM 高糖培养基中。在37℃和5%CO2条件下培养，每两日换液一次，取传代培养3 代的细胞用于后续实验。

2.2 细胞毒性检测

将RAW264.7 细胞接种在96 孔板中，每孔3×103个。实验分为空白组、各浓度（0.1、1、2.5、5、10、100 µmol·L－1）杯苋甾酮组。培养24 h 后，按分组给药处理48 h，每孔加入10 μL CCK-8 试剂，37 ℃避光孵育2 h 后，采用酶标仪在450 nm波长下检测各孔的光密度（OD），计算细胞增殖率：细胞增殖率（%）＝（OD实验组－OD空白溶剂组）/（OD空白组－OD空白溶剂组）×100%。

2.3 杯苋甾酮对RAW264.7 细胞向破骨细胞分化的影响

将RAW264.7 细胞接种在96 孔板中，每孔3×103个。实验分为空白组、模型组、不同浓度（2.5、5、10 µmol·L－1）杯苋甾酮组，并根据文献报道[4]，选用雌激素受体阻断剂ICI 浓度为1µmol·L－1，再设置模型组，ICI 组和杯苋甾酮（5µmol·L－1）＋ICI 组，每组设置3 个复孔。用50 ng·mL－1RANKL 和各浓度的药物/培养基处理各组细胞5 d，每两日换液一次；按TRAP 染色试剂盒说明书方法进行染色；在显微镜下观察和拍照，统计每组破骨细胞数目。

2.4 qRT-PCR 检测破骨细胞分化相关基因TRAP、RANK 和ERα 的表达

将RAW264.7 细胞接种在24 孔板中（每孔1×104个细胞）。常规培养24 h 后，将RAW264.7细胞分为空白组、模型组、不同浓度（2.5、5、10 µmol·L－1）杯苋甾酮组，每组均设置3 个复孔。按“2.3”项下方法诱导RAW264.7 细胞分化为破骨细胞并加药处理，诱导5 d 后采用Trizol法提取细胞中总RNA，用核酸蛋白仪检测每组细胞中总RNA 的浓度和质量后，取1 μg 总RNA按逆转录试剂盒说明书方法逆转录为cDNA，并以cDNA 为模板，按PCR 试剂盒说明书进行扩增。以GAPDH作为内参，破骨细胞分化相关基因TRAP、RANK和ERα的mRNA 表达水平。引物序列及扩增产物大小见表1。

表1 qRT-PCR 所需的引物序列Tab 1 Primer sequences for qRT-PCR

2.5 破骨细胞中ERα 蛋白表达水平测定

采用Western blot 法进行检测。将RAW264.7细胞种植于6 孔板（4×104个/孔）中，培养12 h后，按“2.3”项下方法分组和诱导处理，每两日换液一次，诱导5 d 后，用RIPA 蛋白裂解液提取总蛋白，用BCA 法测蛋白浓度，99℃变性15 min，并置于－20℃冰箱保存备用。蛋白在SDS-PAGE凝胶中电泳；然后转至PVDF 膜，以5%脱脂奶粉室温封闭1 h；用ERα一抗和GAPDH 一抗，4℃孵育过夜；用TBST 清洗3 次，每次15 min，加入HRP 标记二抗，室温孵育1 h；TBST 清洗3 次，每次15 min，加入高敏ECL 化学发光显色底物、UVP/Chemstudio 型多功能化学发光成像系统中成像，然后采用Image J（v1.8.0）软件测定各蛋白条带的灰度值，以目的蛋白和内参GAPDH 蛋白条带的灰度值表示目的蛋白的表达水平。

2.6 杯苋甾酮拟雌激素样实验

MCF-7 细胞培养于无酚红αMEM 完全培养基（含5% HT-FBS 和1%青霉素/链霉素）中培养2 d，以耗尽内源性的拟雌激素[8]，取传代培养3 代的细胞用于后续实验，将MCF-7 细胞种植于96 孔板，并根据杯苋甾酮对RAW264.7 细胞毒性实验结果，分为空白组、各浓度（0.01、0.1、1、2.5、5、10 µmol·L－1）杯苋甾酮组以及空白组＋ICI（1µmol·L－1）组、杯苋甾酮（5 µmol·L－1）＋ICI（1 µmol·L－1）组，每组平行设置5 个复孔，用CCK-8 试剂检测杯苋甾酮对MCF-7 细胞增殖的影响，方法同“2.2”项下。将MCF-7 细胞接种在24孔板中（每孔1×104个细胞）培养24 h 后，分为空白组、各浓度（2.5、5、10 µmol·L－1）杯苋甾酮组，每组设置3 个复孔，各组细胞加入相应药液/培养基处理2 d 后，按“2.4”项下方法检测细胞中ERαmRNA 表达水平。将MCF-7 细胞接种在6 孔板中（每孔1×105个细胞）。培养24 h 后，分为空白组和杯苋甾酮（5 µmol·L－1）组，每组设置3 个复孔。各组细胞加入相应药液/培养基处理2 d 后，按“2.5”项下方法检测细胞中ERα蛋白表达水平。

2.7 杯苋甾酮与雌激素受体模拟对接

分子对接用Moe.2019 将杯苋甾酮与ERα（PDB：1ERE）对接，首先检查蛋白序列完整性，特别是对接口袋蛋白完整性，并对蛋白进行加氢加电荷和能量最小化处理，将杯苋甾酮分子能量最小化后进行构型搜索；然后选择分子与蛋白对接模式，将构象搜索后得的杯苋甾酮与能量最小化后的1ERE 蛋白在雌激素作用口袋处进行模拟对接，观察小分子和蛋白的相互作用位点。

2.8 统计学分析

运用 SPSS 17.0 软件对数据进行统计学分析。计量资料采用（±s）表示，所有实验重复3 次。各组数据符合正态分布，方差齐时采用单因素方差分析，Students't检验；方差不齐时采用非参数检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 杯苋甾酮对RAW264.7 和MCF-7 细胞增殖的影响

与空白组相比，杯苋甾酮100 µmol·L－1显著抑制RAW264.7 细胞的增殖（P＜0.01），其他浓度的杯苋甾酮对RAW264.7 细胞增殖无明显影响，结果见图2。因此，选用2.5、5、10 µmol·L－1用于后续实验。

图2 杯苋甾酮对RAW264.7 细胞增殖的影响Fig 2 Effect of cyasterone on the proliferation of RAW264.7 cells

3.2 杯苋甾酮抑制破骨细胞分化及其相关基因的表达

与模型组相比，各浓度的杯苋甾酮显著抑制RANKL 诱导RAW264.7 细胞分化为破骨细胞（P＜0.001）。qRT-PCR 和Western blot 结果表明，与空白组相比，模型组TRAP 和RANK 表达显著增加，提示破骨细胞诱导成功。与模型组相比，各浓度的杯苋甾酮显著抑制TRAP和RANK表达，且杯苋甾酮（5、10 µmol·L－1）显著上调ERαmRNA 和蛋白水平的表达（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001），并具有剂量依赖性，提示杯苋甾酮可能具有拟雌激素样作用，可通过ER 信号抑制破骨细胞分化（见图3）。

图3 杯苋甾酮对破骨细胞分化（A）及其相关基因和蛋白表达（B）的影响Fig 3 Effect of cyasterone on the differentiation of osteoclasts（A）and expression of related genes and protein（B）

3.3 杯苋甾酮具有拟雌激素样作用

与空白组相比，5、10 µmol·L－1杯苋甾酮显著促进MCF-7 细胞的增殖（见图4A，P＜0.05），用ER 受体阻断剂ICI 阻断雌激素受体后，与杯苋甾酮（5 µmol·L－1）组相比，杯苋甾酮（5µmol·L－1）＋ICI（1 µmol·L－1）抑制MCF-7 细胞的增殖（P＜0.01），提示杯苋甾酮具有拟雌激素样作用。qRT-PCR 和Western blot 检测结果表明，与空白组相比，各组杯苋甾酮显著促进ERαmRNA 水平的表达，并具有剂量依赖性（P＜0.05，P＜0.01），且杯苋甾酮（5 µmol·L－1）上调ERα蛋白水平的表达（P＜0.05），见图4B。表明杯苋甾酮（5、10 µmol·L－1）具有拟雌激素样作用，因此选择杯苋甾酮（5 µmol·L－1）用于后续实验。

图4 杯苋甾酮对MCF-7 细胞增殖（A）和ERα 表达（B）的影响Fig 4 Effect of cyasterone on the proliferation of MCF-7 cells（A）and ERα expression（B）

3.4 杯苋甾酮与ERα 模拟对接

为了进一步验证杯苋甾酮的拟雌激素样作用，我们采用分子对接发现杯苋甾酮与17-β雌二醇具有相同的作用位点是在Glu-353 和His-524（见图5A、图5B）。此外，杯苋甾酮在17-β雌二醇作用口袋还有Ala-350、Met-388 和Met-421 等作用位点（见图5B），进一步证实了杯苋甾酮具有拟雌激素样作用，提示杯苋甾酮可能通过ER信号通路抑制破骨细胞分化。

图5 杯苋甾酮与ERα 分子对接Fig 5 Molecular docking of cyasterone and ERα

3.5 杯苋甾酮通过ERα 信号通路抑制破骨细胞分化

采用TRAP 染色和qRT-PCR 检测ICI 阻断ER 后，杯苋甾酮对破骨细胞分化及其相关基因表达的影响。结果表明，与模型组相比，杯苋甾酮（5 µmol·L－1）显著抑制破骨细胞的分化，以及TRAP和RANKmRNA 水平的表达（P＜0.05，P＜0.01）；与杯苋甾酮组相比，杯苋甾酮＋ICI 组抑制破骨细胞分化的作用显著降低，上调TRAP和RANKmRNA 水平的表达（P＜0.01），证实杯苋甾酮可能是通过ER 信号通路抑制破骨细胞的分化（见图6）。

图6 ICI 对杯苋甾酮抑制破骨细胞分化及其相关基因表达的影响Fig 6 Effect of ICI on cyasterone inhibiting the osteoclast differentiation

4 讨论

雌激素分泌不足是妇女绝经后诱发OP 的主要原因。因此，雌激素替代疗法是治疗绝经后OP 的主要方法。近年来，大量研究发现诸多中药含有PE，有拟雌激素样作用，具有疗效好、副作用小、效优价廉的特点，并应用于OP 的治疗[9]。杯苋甾酮是一类甾体化合物，具有植物雌激素β-蜕皮甾酮相似的结构[10]。因此，本研究首先用MCF-7 细胞证实了杯苋甾酮（5、10 µmol·L－1）促进MCF-7 细胞的增殖，上调ERαmRNA 和蛋白水平的表达，且雌激素受体竞争性阻断剂ICI可阻断该作用，证实了杯苋甾酮具有拟雌激素样作用。其中，MCF-7 细胞是ER 阳性表达的人源乳腺癌细胞，是PE 和拟雌激素药物研究的主要靶细胞，一般来说，具有拟雌激素样作用的药物可以显著促进MCF-7 细胞的增殖及其相关基因（ERα和ERβ）的表达[11-12]。

ER 是雌激素和PE 作用的直接靶点，特别是在破骨细胞和OP 中，ERα是发挥作用的主要靶点，有研究表明，在ERα敲除的去卵巢大鼠中，雌激素无抗OP 作用，不能减少去卵巢大鼠骨丢失，而在敲除ERβ的去卵巢大鼠中，雌激素具有骨保护作用，且效果和对照组无差异[13-15]。本研究通过TRAP 染色和qRT-PCR、Western blot 检测证实杯苋甾酮显著抑制RANKL 诱导的RAW264.7细胞分化为破骨细胞和TRAP、RANK基因的表达，上调ER 信号通路上关键靶点ERα基因和蛋白水平的表达，而ICI 阻断杯苋甾酮对破骨细胞分化的抑制效应。此外，分子对接发现杯苋甾酮与17-β雌二醇具有相同的作用位点是在Glu-353 和His-524，且杯苋甾酮在17-β雌二醇作用口袋还有Ala-350、Met-388 和Met-421 等作用位点，因此，本实验结果表明杯苋甾酮可能是通过ER 通路抑制破骨细胞的分化，且ERα是杯苋甾酮的作用靶点。