亚乎奴萜类和生物碱类化学成分研究

潘如意，孙彦君*，陈豪杰，李 孟，司盈盈，冯卫生*

亚乎奴萜类和生物碱类化学成分研究

潘如意1, 2, 3，孙彦君1, 2, 3*，陈豪杰1, 2，李 孟1, 2，司盈盈1, 2，冯卫生1, 2*

1. 河南中医药大学 呼吸疾病中医药防治省部共建协同创新中心，河南 郑州 450046 2. 河南中医药大学药学院, 河南 郑州 450046 3. 河南省中药特色炮制技术工程研究中心，河南 郑州 450046

研究亚乎奴var.的萜类和生物碱类化学成分。采用硅胶、Sephadex LH-20、ODS、MCI等柱色谱和半制备液相色谱对其化学成分进行分离纯化，通过MS、NMR等波谱分析技术，结合理化性质分析，鉴定化合物结构。采用MTS法，测试化合物1、2、4、6～9、13、14对人急性早幼粒白血病HL-60细胞、人肺癌A549细胞、人肝癌SMMC-7721细胞、人乳腺癌MCF-7细胞、人结肠癌SW480细胞的细胞毒性。从亚乎奴95%乙醇提取物中分离得到15个化合物，分别鉴定为羽扇豆醇（1）、白桦脂醇（2）、3β,14-二羟基-14β-孕甾-5-烯-20-酮（3）、3β-羟基-l7β-孕甾-5-烯-7,20-二酮（4）、假虎刺酮（5）、脱氢地芰普内酯（6）、黑麦草内酯（7）、(＋)-去氢催吐萝芙木醇（8）、(3,5,6,7)-3,5,6-三羟基-7-巨豆烯-9-酮（9）、(6,7,9)-9-羟基-4,7-巨豆二烯-3-酮（10）、催吐萝芙木醇（11）、8,9-二氢-8,9-二羟基巨豆三烯酮（12）、橙黄胡椒酰胺乙酸酯（13）、橙黄胡椒酰胺（14）、橙黄胡椒酰胺苯甲酸酯（15）。MTS测试结果显示，化合物2对A549细胞和SMMC-7721细胞具有一定的细胞毒活性，半数抑制浓度（median inhibition concentration，IC50）值分别为23.62、27.46 μmol/L。所有化合物均为首次从锡生藤属植物中分离得到，包括三萜类化合物4个（1～4）、单萜类化合物8个（5～12）、生物碱类化合物3个（13～15）。羽扇豆烷型三萜可能为亚乎奴药材抗肿瘤活性的药效物质基础。

亚乎奴；萜类化合物；细胞毒活性；羽扇豆烷型三萜；白桦脂醇；橙黄胡椒酰胺

亚乎奴为防己科植物锡生藤var.(Buch. ex DC.) Forman的干燥全株，为傣族习用药材，具有消肿止痛，止血，生肌之功效[1]。现代药理研究表明，亚乎奴具有抗炎、抗氧化、抗病毒、抗菌、抗肿瘤、抗蛇毒等作用[2-3]。目前，已从该植物中发现了生物碱、黄酮、萜类、甾体、小分子酚酸等类型化学成分[4]，关于其化学成分的研究多集中于生物碱，为进一步阐明其药效物质基础，为开发利用提供理论依据，本课题组对亚乎奴95%乙醇提取物的中的生物碱和萜类化合物进行研究，共分离鉴定了15个化合物，分别为羽扇豆醇（lupeol，1）、白桦脂醇（betulin，2）、3β,14-二羟基-14β-孕甾-5-烯-20-酮（3β,14-dihydroxy- 14β-pregn-5-en-20-one，3）、3β-羟基-l7β-孕甾-5-烯- 7,20-二酮（3β-hydroxy-l7β-pregn-5-ene-7,20-dione，4）、假虎刺酮（carissone，5）、脱氢地芰普内酯（dehydrololiolide，6）、黑麦草内酯（loliolide，7）、(＋)-去氢催吐萝芙木醇（dehydrovomifoliol，8）、(3,5,6,7)-3,5,6-三羟基-7-巨豆烯-9-酮 [(3,5, 6,7)-3,5,6-trihydroxy-7-megastigmen-9-one，9]、(6,7,9)-9-羟基-4,7-巨豆二烯-3-酮 [(6,7,9)-9- hydroxy-4,7-megastigmadien-3-one，10]、催吐萝芙木醇（vomifoliol，11）、8,9-二氢-8,9-二羟基巨豆三烯酮（8,9-dihydro-8,9-dihydroxymegastigmatrienone，12）、橙黄胡椒酰胺乙酸酯（aurantiamide acetate，13）、橙黄胡椒酰胺（aurantiamide，14）、橙黄胡椒酰胺苯甲酸酯（aurantiamide benzoate，15）。所有化合物均为首次从锡生藤属植物中分离得到。采用MTS法，对化合物1、2、4、6～9、13、14进行了体外细胞毒活性评价，结果显示化合物2对人肺癌细胞A549和人肝癌细胞SMMC-7721细胞显示一定的细胞毒活性，半数抑制浓度（median inhibition concentration，IC50）值分别为23.62、27.46 μmol/L。

1 仪器与材料

Bruker AVANCE Ⅲ 500型核磁共振仪（德国Bruker公司）；Bruker maxis HD型飞行时间质谱（德国Bruker公司）；制备型高效液相色谱仪（北京赛谱锐思科技有限公司）；N-1000型旋转蒸发仪（上海爱朗仪器有限公司）；SHB-B95A型循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）；DFZ-3型真空干燥箱（上海医用恒温设备厂）；薄层色谱硅胶GF254、柱色谱硅胶（200～300目，青岛海洋化工有限公司）；Sephadex LH-20（Pharmacia Biotech公司）；ODS（100 μm，YMC）；MCI Gel CHP-20（日本三菱化学）；甲醇，色谱纯（天津市四友精细化学品有限公司）；MTS（美国Promega公司）；其他试剂均为分析级。

人急性早幼粒白血病HL-60细胞株、人肺癌A549细胞株、人肝癌SMMC-7721细胞株、人乳腺癌MCF-7细胞株、人结肠癌SW480细胞株均购买自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。

亚乎奴药材采集于云南，经河南中医药大学药学院董诚明教授鉴定为锡生藤属植物锡生藤var.(Buch. ex DC.) Forman的干燥全株。

2 提取与分离

取干燥的亚乎奴药材50.66 kg，用95%乙醇回流提取3次，每次2 h，减压浓缩得总浸膏2 736.5 g。用蒸馏水混悬，依次用石油醚、氯仿、正丁醇萃取，得到石油醚萃取部位（351.1 g）、氯仿萃取部位（740.1 g）、正丁醇萃取部位（594.5 g）及水萃取部位（562.8 g）。

将氯仿萃取部位经硅胶柱色谱分离，以石油醚-丙酮（100∶0～1∶2）梯度洗脱得到5个组分Fr. C1～C5。组分Fr. C2经硅胶柱色谱分离后，重结晶得到化合物1（10 mg）。组分Fr. C3经硅胶柱色谱分离，以石油醚-醋酸乙酯（100∶0～100∶50）梯度洗脱，得到7个亚组分Fr. C3-1～C3-7。亚组分Fr.C3-3经Sephadex LH-20柱色谱[二氯甲烷-甲醇（1∶1）洗脱] 分离，得到Fr. C3-3-1～C3-3-5。Fr.C3-3-4经ODS柱色谱分离，以甲醇-水（30%、50%、70%、73%、76%、79%、82%、85%、90%、100%）梯度洗脱，得到10个组分Fr. C3-3-4-1～C3-3-4-10。组分Fr. C3-3-4-1经硅胶柱色谱分离，以石油醚-醋酸乙酯梯度（100∶0～100∶50）梯度洗脱，得到组分Fr. C3-3-4-1-3，再经制备型高效液相色谱（23%乙腈）分离，得到化合物5（3.6 mg，R＝45.7 min）、6（11.2 mg，R＝43.5 min）。组分Fr. C3-3-4-8经硅胶柱色谱分离，以石油醚-醋酸乙酯（100∶0～100∶30）洗脱，得到化合物2（5.6 mg）。Fr.C3-4经MCI柱色谱分离，甲醇-水（20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%）洗脱，得到9个亚组分Fr. C3-4-1～C3-4-9。亚组分Fr. C3-4-3经制备型高效液相色谱（43%甲醇）分离，得到化合物8（16 mg，R＝23.0 min）。亚组分Fr.C3-4-4以经制备型高效液相色谱（53%甲醇）分离，得到化合物9（3 mg，R＝26.0 min）、10（3.5 mg，R=32.4 min）。组分Fr. C4经MCI柱色谱分离，以甲醇-水（10%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、100%）梯度洗脱，得到8个亚组分Fr.C4-1～Fr.C4-6。经薄层色谱检识，将Fr.C4-1经硅胶柱色谱分离，用石油醚-丙酮（100∶0～1∶2）梯度洗脱，得到5个亚组分Fr. C4-1-1～C4-1-5。Fr.C4-1-3经硅胶柱色谱分离，以石油醚-醋酸乙酯（50∶1～1∶2）洗脱，得到组分Fr. C4-1-3-1～C4-1-3-4。Fr. C4-1-3-2经制备型高效液相色谱（37%甲醇，6 mL/min）分离，得到化合物7（3.0 mg，R＝40.1 min）。亚组分Fr. C4-1-4用Sephadex LH-20柱色谱分离，以甲醇洗脱，得到Fr. C4-1-4-1～C4-1-4-3。Fr. C4-1-4-2经制备型高效液相色谱分离，第1次用35%甲醇（R＝32.9 min）洗脱，第2次用25%乙腈（6 mL/min）制备得到化合物11（17 mg，R＝27.4 min）、12（3.3 mg，R＝40.5 min）。组分Fr. C4-2经Sephadex LH-20（甲醇洗脱）柱色谱分离，得到6个亚组分Fr. C4-2-1～C4-2-6。亚组分Fr. C4-2-2经硅胶柱色谱分离，以二氯甲烷-甲醇（80∶1～10∶1）梯度洗脱，得到5个组分Fr. C4-2-2-1～C4-2-2-5，组分Fr. C4-2-2-1经制备型高效液相色谱（52%乙腈，6 mL/min）分离，得到化合物3（4.5 mg，R＝34.8 min）、4（3.6 mg，R＝21.2 min）。组分Fr. C4-3经硅胶柱色谱分离，用石油醚-醋酸乙酯（10∶1～1∶2）梯度洗脱，得到5个亚组分Fr. C4-3-1～C4-3-5。Fr. C4-3-3经制备型高效液相色谱（50%乙腈，6 mL/min）分离，得到化合物14（7.4 mg，R＝40.2 min）。组分Fr. C4-4经硅胶柱色谱分离，以石油醚-醋酸乙酯（10∶1～1∶2）梯度洗脱，得到5个亚组分Fr. C4-4-1～C4-4-4。亚组分Fr. C4-4-3通过重结晶，得到化合物13（30 mg）。组分Fr. C4-5经硅胶柱色谱分离，以石油醚-醋酸乙酯（10∶1～1∶2，纯甲醇）梯度洗脱，得到3个亚组分Fr. C4-5-1～C4-5-3。亚组分Fr. C4-5-2经Sephadex LH-20（甲醇洗脱）分离，得到5个组分Fr. C4-5-2-1～C4-5-2-5。Fr. C4-5-2-2经制备型高效液相色谱（75%甲醇，6 mL/min）分离，得到化合物15（19 mg，R＝44.8 min）。

3 结构鉴定

化合物1：白色粉末。1H-NMR (500 MHz, C5D5N): 3.45 (1H, m, H-3), 2.47 (1H, dd,= 16.1, 10.5 Hz, H-19), 1.02 (3H, s, H-23), 0.87 (3H, s, H-24), 0.96 (3H, s, H-25), 1.23 (3H, s, H-26), 1.04 (3H, s, H-27), 0.81 (3H, s, H-28), 4.87 (1H, brs, H-29a), 4.72 (1H, brs, H-29b), 1.73 (3H, s, H-30)；13C-NMR (125 MHz, C5D5N): 39.1 (C-1), 27.6 (C-2), 77.9 (C-3), 39.3 (C-4), 55.6 (C-5), 18.6 (C-6), 34.5 (C-7), 40.9 (C-8), 50.5 (C-9), 37.3 (C-10), 20.9 (C-11), 25.3 (C-12), 38.1 (C-13), 42.8 (C-14), 27.6 (C-15), 35.6 (C-16), 43.0 (C-17), 48.0 (C-18), 48.4 (C-19), 150.8 (C-20), 29.9 (C-21), 40.0 (C-22), 28.1 (C-23), 16.1 (C-24), 16.2 (C-25), 16.0 (C-26), 14.5 (C-27), 18.0 (C-28), 109.7 (C-29), 19.2 (C-30)。以上数据与文献报道基本一致[5]，故鉴定化合物1为羽扇豆醇。

化合物2：白色针晶（二氯甲烷）。mp 236～238 ℃。1H-NMR (500 MHz, C5D5N): 3.45 (1H, dd,= 8.0, 1.5 Hz, H-3), 0.95 (3H, s, H-23), 0.81 (3H, s, H-24), 0.86 (3H, s, H-25), 1.01 (3H, s, H-26), 1.03 (3H, s, H-27), 4.47 (2H, m, H-28), 5.49 (1H, brs, H-29a), 5.11 (1H, brs, H-29b), 1.22 (3H, s, H-30)；13C-NMR (125 MHz, C5D5N): 40.8 (C-1), 29.1 (C-2), 79.4 (C-3), 40.6 (C-4), 57.1 (C-5), 20.0 (C-6), 39.6 (C-7), 41.4 (C-8), 52.0 (C-9), 37.0 (C-10), 22.4 (C-11), 28.2 (C-12), 38.7 (C-13), 42.4 (C-14), 29.6 (C-15), 31.3 (C-16), 44.3 (C-17), 50.2 (C-18), 44.5 (C-19), 157.8 (C-20), 33.4 (C-21), 36.0 (C-22), 30.0 (C-23), 17.5 (C-24), 17.7 (C-25), 17.6 (C-26), 16.0 (C-27), 65.5 (C-28), 107.5 (C-29), 19.2 (C-30)。以上数据与文献报道基本一致[6]，故鉴定化合物2为白桦酯醇。

化合物3：白色粉末。1H-NMR (500 MHz, CD3OD): 2.25 (1H, m, H-1a), 1.73 (1H, m, H-1b), 3.42 (1H, m, H-3), 5.41 (1H, m, H-6), 1.81 (1H, m, H-8), 1.12 (1H, m, H-9), 2.14 (1H, m, H-11a), 2.04 (1H, m, H-11b), 1.31 (1H, m, H-12a), 1.23 (1H, m, H-12b), 1.92 (1H, m, H-15a), 1.81 (1H, m, H-15b), 1.92 (2H, m, H-16), 3.00 (1H, dd,= 9.5, 4.5 Hz, H-17), 1.01 (3H, s, H-18), 1.04 (3H, s, H-19), 2.27 (3H, s, H-21)；13C-NMR (125 MHz, CD3OD): 38.5 (C-1), 32.2 (C-2), 72.3 (C-3), 42.8 (C-4), 141.0 (C-5), 122.7 (C-6), 28.3 (C-7), 37.8 (C-8), 47.4 (C-9), 38.1 (C-10), 21.8 (C-11), 39.6 (C-12), 50.2 (C-13), 86.9 (C-14), 35.1 (C-15), 25.2 (C-16), 63.8 (C-17), 15.5 (C-18), 19.9 (C-19), 219.1 (C-20), 32.2 (C-21)。以上数据与文献报道基本一致[7]，故鉴定化合物3为3β,14-二羟基-14β-孕甾-5-烯-20-酮。

化合物4：白色粉末。1H-NMR (500 MHz, CD3OD): 2.27 (1H, t,= 11.3 Hz, H-1a), 1.70 (1H, overlapped, H-1b), 3.69 (1H, m, H-3), 2.56-2.37 (2H, overlapped, H-4), 5.72 (1H, s, H-6), 1.81-1.51 (1H, overlapped, H-8), 1.50～1.33 (2H, overlapped, H-16), 2.05 (1H, m, H-11a), 1.81-1.51 (1H, overlapped, H-11b), 1.50～1.33 (2H, overlapped, H-12), 1.97 (1H, m, H-15a), 1.81～1.51 (1H, overlapped, H-15b), 1.81～1.51 (1H, overlapped, H-9), 2.05 (1H, dd,= 12.6, 3.4 Hz, H-17), 0.66 (3H, s, H-18), 1.21 (3H, s, H-19), 2.13 (3H, s, H-21)；13C-NMR (125 MHz, CD3OD): 36.4 (C-1), 31.1 (C-2), 70.5 (C-3), 41.8 (C-4), 165.4 (C-5), 125.9 (C-6), 201.5 (C-7), 45.2 (C-8), 49.8 (C-9), 38.3 (C-10), 21.1 (C-11), 37.7 (C-12), 44.4 (C-13), 50.0 (C-14), 26.5 (C-15), 23.6 (C-16), 62.3 (C-17), 13.3 (C-18), 17.3 (C-19), 209.7 (C-20), 31.6 (C-21)。以上数据与文献报道基本一致[8]，故鉴定化合物4为3β-羟基-l7β-孕甾-5-烯-7,20-二酮。

化合物5：白色粉末。1H-NMR (500 MHz, CD3OD): 2.55 (1H, ddd,= 17.0, 11.7, 8.1 Hz, H-2a), 2.33 (1H, overlapped, H-2b), 1.89 (1H, overlapped, H-6a), 2.92 (1H, m, overlapped, H-6b), 1.28 (6H, s, H-12, 13), 1.75 (3H, d,= 1.1 Hz, H-14), 1.20 (3H, s, H-15)；13C-NMR (125 MHz, CD3OD): 37.2 (C-1), 34.6 (C-2), 201.5 (C-3), 129.5 (C-4), 166.4 (C-5), 30.0 (C-6), 51.2 (C-7), 22.7 (C-8), 43.3 (C-9), 35.1 (C-10), 10.9 (C-11), 73.0 (C-12), 26.2 (C-13), 27.5 (C-14), 22.7 (C-15)。以上数据与文献报道基本一致[9]，故鉴定化合物5为假虎刺酮。

化合物6：白色粉末。1H-NMR (500 MHz, CD3OD): 2.90 (1H, dd,= 13.7, 1.8Hz, H-2a), 2.83 (1H, d,= 13.7 Hz, H-2b), 2.58 (1H, d,= 14.4 Hz, H-4a), 2.48 (1H, dd,= 14.4, 1.8 Hz, H-4b), 6.07 (1H, s, H-7), 1.32 (3H, s, H-9), 1.44 (3H, s, H-10), 1.60 (3H, s, H-11)；13C-NMR (125 MHz, CD3OD): 36.7 (C-1), 54.8 (C-2), 206.8 (C-3), 53.7 (C-4), 87.9 (C-5), 173.3 (C-6), 115.3 (C-7), 181.0 (C-8), 27.2 (C-9), 29.9 (C-10), 26.2 (C-11)。以上数据与文献报道基本一致[10]，故鉴定化合物6为脱氢地芰普内酯。

化合物7：无色结晶（甲醇）。mp 152～153 ℃。1H-NMR (500 MHz, CD3OD): 2.01 (1H, dt,= 14.4, 2.6 Hz, H-2a), 1.55 (1H, dd,= 14.4, 3.6 Hz, H-2b), 4.23 (1H, m, H-3), 2.45 (1H, dt,= 13.8, 2.4 Hz, H-4a), 1.76 (1H, dd,= 14.4, 3.6 Hz, H-4b), 5.77 (1H, s, H-7), 1.48 (3H, s, H-9), 1.29 (3H, s, H-10), 1.78 (3H, s, H-11)；13C-NMR (125 MHz, CD3OD): 37.2 (C-1), 48.0 (C-2), 67.2 (C-3), 46.3 (C-4), 88.9 (C-5), 174.4 (C-6), 113.3 (C-7), 185.7 (C-8), 27.0 (C-9), 27.4 (C-10), 30.0 (C-11)。以上数据与文献报道基本一致[11]，故鉴定化合物7为黑麦草内酯。

化合物8：白色粉末。1H-NMR (500 MHz, CD3OD): 2.62 (1H, d,= 17.2 Hz, H-2a), 2.29 (1H, d,= 17.2 Hz, H-2b), 5.95 (1H, s, H-4), 7.01 (1H, d,= 15.9 Hz, H-7), 6.45 (1H, d,= 15.9 Hz, H-8), 2.32 (3H, s, H-10), 1.08 (3H, s, H-11), 1.04 (3H, s, H-12), 1.92 (3H, d,= 1.2 Hz, H-13)；13C-NMR (125 MHz, CD3OD): 42.6 (C-1), 50.5 (C-2), 200.3 (CO), 128.0 (C-4), 164.6 (C-5), 80.0 (C-6), 148.3 (C-7), 131.7 (C-8), 200.6 (CO), 27.6 (C-10), 23.5 (C-11), 24.7 (C-12), 19.1 (C-13)。以上数据与文献报道基本一致[12]，故鉴定化合物8为(＋)-去氢催吐萝芙木醇。

化合物9：无色油状物。1H-NMR (500 MHz, CD3OD): 1.29(1H, m, H-2a), 1.60 (1H, m, H-2b), 3.78 (1H, m, H-3), 1.67 (4H, dd,= 14.3, 9.2 Hz, H-4a), 2.29 (1H, m, H-4b), 6.20 (1H, d,= 15.8 Hz, H-7), 7.18 (1H, d,= 15.8 Hz, H-8), 2.31 (3H, s, H-10), 1.20 (3H, s, H-11), 0.98 (3H, s, H-12), 1.21 (3H, s, H-13)；13C-NMR (125 MHz, CD3OD): 36.1 (C-1), 47.6 (C-2), 64.4 (C-3), 41.3 (C-4), 68.8 (C-5), 70.8 (C-6), 145.4 (C-7), 133.8 (C-8), 200.2 (CO), 25.1 (C-10), 29.8 (C-11), 27.4 (C-12), 20.0 (C-13)。以上数据与文献报道基本一致[13]，故鉴定化合物9为(3,5,6,7)-3,5,6-三羟基-7-巨豆烯-9-酮。

化合物10：无色油状物。1H-NMR (500 MHz, CD3OD): 2.42 (1H, d,= 16.8 Hz, H-2a), 2.07 (1H, d,= 16.7 Hz, H-2b), 5.90 (1H, s, H-4), 2.68 (1H, d,= 9.1 Hz, H-6), 5.60 (1H, dd,= 16.0, 9.2 Hz, H-7), 5.72 (1H, dd,= 15.3, 5.8 Hz, H-8), 4.29 (1H, m, H-9), 1.26 (3H, d,= 6.4 Hz, H-10), 1.05 (3H, s, H-11), 1.01 (3H, s, H-12), 1.94 (3H, s, H-13)；13C-NMR (125 MHz, CD3OD): 37.1 (C-1), 48.4 (C-2), 202.0 (C-3), 127.2 (C-4), 166.0 (C-5), 56.7 (C-6), 126.1 (C-7), 140.2 (C-8), 68.8 (C-9), 23.8 (C-10), 27.3 (C-11), 28.0 (C-12), 23.7 (C-13)。以上数据与文献报道基本一致[14]，故鉴定化合物10为(6,7,9)-9-羟基-4,7-巨豆二烯-3-酮。

化合物11：无色油状物。1H-NMR (500 MHz, CD3OD): 2.54 (1H, d,= 17.0 Hz, H-2a), 2.18 (1H, t,= 16.6 Hz, H-2b), 5.90 (1H, s, H-4), 5.79 (1H, d,= 15.7 Hz, H-7), 5.83 (1H, d,= 15.7 Hz, H-8), 4.34 (1H, m, H-9), 1.26 (3H, d,= 6.4 Hz, H-10), 1.03 (3H, s, H-11), 1.06 (3H, s, H-12), 1.94 (3H, s, H-13)；13C-NMR (125 MHz, CD3OD): 42.4 (C-1), 50.7 (C-2), 201.3 (CO), 127.1 (C-4), 167.4 (C-5), 80.0 (C-6), 130.1 (C-7), 136.9 (C-8), 68.7 (C-9), 23.8 (C-10), 24.5 (C-11), 23.5 (C-12), 19.6 (C-13)。以上数据与文献报道基本一致[12]，故鉴定化合物11为催吐萝芙木醇。

化合物12：无色油状物。1H-NMR (500 MHz, CD3OD): 2.41 (1H, d,= 16.0 Hz, H-2a), 2.34 (1H, d,= 16.0 Hz, H-2b), 5.96 (1H, s, H-4), 6.01 (1H, d,= 9.8 Hz, H-7), 4.62 (1H, dd,= 9.8, 5.6 Hz, H-8), 3.69 (1H, m, H-9), 1.18 (3H, d,= 6.4 Hz, H-10), 1.32 (3H, s, H-11), 1.40 (3H, s, H-12), 2.13 (3H, d,= 0.8 Hz, H-13)；13C-NMR (125 MHz, CD3OD): 40.0 (C-1), 54.4 (C-2), 201.8 (C-3), 127.3 (C-4), 158.8 (C-5), 145.1 (C-6), 135.2 (C-7), 72.5 (C-8), 71.3 (C-9), 19.4 (C-10), 30.0 (C-11), 29.9 (C-12), 22.7 (C-13)。以上数据与文献报道基本一致[15]，故鉴定化合物12为8,9-二氢-8,9-二羟基巨豆三烯酮。

化合物13：白色针晶（二氯甲烷）。mp 186～188 ℃。1H-NMR (500 MHz, CDCl3): 4.78 (1H, dd,= 14.0, 7.9 Hz, H-2), 3.22 (1H, dd,= 13.6, 5.9 Hz, H-3a), 3.07 (1H, dd,= 13.6, 8.4 Hz, H-3b), 7.25 (5H, m, H-5～9), 7.71 (2H, d,= 7.6 Hz, H-3′, 7′), 7.44 (2H, t,= 7.6 Hz, H-4′, 6′), 7.52 (1H, t,= 7.4 Hz, H-5′), 4.34 (1H, m, H-1′′), 2.75 (2H, m, H-2′′), 7.07 (2H, d,= 6.9 Hz, H-4′′, 8′′), 7.15 (3H, m, overlapped, H-5′′, 6′′, 7′′), 3.93 (1H, dd,= 11.3, 4.9 Hz, H-9′′a), 3.82 (1H, dd,= 11.3, 4.2 Hz, H-9′′b), 2.01 (3H, s, COCH3), 6.17 (1H, d,= 6.8 Hz, α-NH), 6.85 (1H, d,= 6.8 Hz, β-NH)；13C-NMR (125 MHz, CDCl3): 170.3 (C-1), 55.0 (C-2), 38.5 (C-3), 136.7 (C-4), 128.7 (C-5, 9), 129.3 (C-6, 8), 127.1 (C-7), 167.1 (C-1′), 133.6 (C-2′), 128.6 (C-3′, 7′, 4′′, 8′′), 127.1 (C-4′, 6′), 131.9 (C-5′), 49.4 (C-1′′), 37.1 (C-2′′), 136.6 (C-3′′), 129.1 (C-5′′, 7′′), 126.7 (C-6′′), 64.6 (C-9′′), 20.8 (COCH3), 170.8 (COCH3)。以上数据与文献报道基本一致[16]，故鉴定化合物13为橙黄胡椒酰胺乙酸酯。

化合物14：白色针晶（二氯甲烷）。mp 180～182 ℃。1H-NMR (500 MHz, CD3OD): 4.78 (1H, dd,= 8.9, 6.2 Hz, H-2), 3.15 (1H, dd,= 13.8, 6.1 Hz, H-3a), 2.94 (1H, dd,= 13.8, 6.1 Hz, H-3b), 7.25 (5H, m, H-5～9), 7.69 (2H, d,= 7.3 Hz, H-3′, 7′), 7.43 (2H, t,= 7.3 Hz, H-4′, 6′), 7.52 (1H, t,= 7.4 Hz, H-5′), 4.07 (1H, dd,= 11.2, 5.6 Hz, H-1′′), 2.94 (1H, dd,= 13.8, 7.5 Hz, H-2′′a), 2.71 (1H, dd,= 13.6, 8.2 Hz, H-2′′b), 7.17 (5H, m, H-4′′～8′′), 3.42 (2H, m, H-9′′)；13C-NMR (125 MHz, CD3OD): 173.3 (C-1), 56.6 (C-2), 38.8 (C-3), 139.6 (C-4), 129.3 (C-5, 9), 130.4 (C-6, 8), 127.7 (C-7), 170.0 (C-1′), 135.3 (C-2′), 129.4 (C-3′, 7′), 128.5 (C-4′, 6′), 132.8 (C-5′), 54.4 (C-1′′), 37.9 (C-2′′), 138.6 (C-3′′), 130.4 (C-4′′, 8′′), 129.5 (C-5′′, 7′′), 127.3 (C-6′′), 63.9 (C-9′′)。以上数据与文献报道基本一致[16-17]，故鉴定化合物14为橙黄胡椒酰胺。

化合物15：白色粉末。1H-NMR (500 MHz, CD3OD): 4.79 (1H, dd,= 9.4, 5.8 Hz, H-2), 3.13 (1H, m, H-3a), 2.89 (1H, m, H-3b), 7.21 (5H, m, H-5～9), 7.68 (2H, overlapped, H-3′, 7′), 7.48 (2H, overlapped, H-4′, 6′), 7.36 (1H, overlapped, H-5′), 4.13 (1H, dd,= 11.2, 6.3 Hz, H-1′′), 7.21 (5H, m, H-4′′～8′′), 3.27 (2H, overlapped, H-9′′), 7.68 (2H, overlapped, H-3′′′, 7′′′), 7.48 (2H, overlapped, H-4′′′, 6′′′), 7.36 (1H, overlapped, H-5′′′)；13C-NMR (125 MHz, CD3OD): 170.3 (C-1), 56.3 (C-2), 37.9 (C-3), 135.7 (C-4), 126.8～127.0 (C-5～9), 173.1 (C-1′), 134.4 (C-2′), 127.6 (C-3′, 7′), 128.5 (C-4′, 6′), 132.6 (C-5′), 51.9 (C-1′′), 38.0 (C-2′′), 138.6 (C-3′′), 126.8-127.0 (C-4′′～8′′), 66.8 (C-9′′), 170.3 (C-1′′′), 134.4 (C-2′′′), 127.6 (C-3′′′, 7′′′), 128.5 (C-4′′′, 6′′′), 132.5 (C-5′′′)。以上数据与文献报道基本一致[18]，故鉴定化合物15为橙黄胡椒酰胺苯甲酸酯。

4 细胞毒活性评价

以顺铂为阳性对照药，将100 µL的肿瘤细胞（人急性早幼粒白血病HL-60细胞、人肺癌A549细胞、人肝癌SMMC-7721细胞、人乳腺癌MCF-7细胞、人结肠癌SW480细胞）接种到96孔细胞培养板中，培养24 h。将待测化合物（1、2、4、6～9、13、14）以40、8、1.6、0.32和0.064 μmol/L的浓度加入，继续培养48 h后，向每个孔中加入MTS（20 µL），并在37 ℃下继续培养4 h。在492 nm处测量吸光度。待测化合物对肿瘤细胞细胞毒活性的IC50值用Reed-Muench方法计算。结果显示，化合物2对人肺癌A549细胞和人肝癌SMMC-7721细胞显示一定的细胞毒活性，IC50值为（23.62±1.63）和（27.46±0.87）μmol/L，其余化合物IC50均大于50 μmol/L。

5 讨论

本实验运用多种色谱分离技术对锡生藤属植物亚乎奴的化学成分进行分离纯化，得到15个化合物（1～15），包括三萜类化合物4个（1～4）、单萜类化合物8个（5～12）、生物碱类化合物3个（13～15），首次在锡生藤属植物中发现了单萜类和酰胺类生物碱的存在，对防己科锡生藤属植物与其他属植物的植物化学分类学研究具有重要的指导意义。

对化合物1、2、4、6～9、13、14进行了肿瘤细胞毒活性的测定，测试结果显示所供试化合物中，化合物2对A549细胞和SMMC-7721细胞具有一定的细胞毒活性，提示本药材可能具有抗肿瘤活性，羽扇豆烷型三萜类化合物可能是亚乎奴发挥其抗肿瘤活性的药效物质基础。从亚乎奴中分离得到的3个酰胺类生物碱结构新颖独特，文献报道具有抗炎活性[19-20]，鉴于傣药亚乎奴临床上用于消肿止痛，提示酰胺类生物碱可能是亚乎奴发挥抗炎作用的药效物质基础，但具体的作用机制还需要进一步深入研究。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突

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Terpenoids and alkaloids fromvar.

PAN Ru-yi1, 2, 3, SUN Yan-jun1, 2, 3, CHEN Hao-jie1, 2, LI Meng1, 2, SI Ying-ying1, 2, FENG Wei-sheng1, 2

1. Co-construction Collaborative Innovation Center for Chinese Medicine and Respiratory Diseases by Henan & Education Ministry of China, Henan University of Chinese Medicine, Zhengzhou 450046, China 2. School of Pharmacy, Henan University of Chinese Medicine, Zhengzhou 450046, China 3. Henan Research Center for Special Processing Technology of Chinese Medicine, Zhengzhou 450046, China

To study the terpenoids and alkaloids fromvar..The compounds were isolated and purified by silica gel, Sephadex LH-20, ODS, MCI column chromatography and preparative HPLC, and their structures were identified by physicochemical properties, NMR and MS. Compounds 1, 2, 4, 6—9, 13 and 14 were tested for their cytotoxicity in human liver cancer SMMC-7721, breast cancer MCF-7, leukemia HL-60, lung cancer A549, colon cancer SW480 cell lines by MTS.Fifteen compounds were isolated from the 95% ethanol extract ofvar., and their structures were identified as lupeol (1), betulin (2), 3β,14-dihydroxy-14β-pregn-5-en-20-one (3), 3β-hydroxy-l7β-pregn-5- ene-7,20-dione (4), carissone (5), dehydrololiolide (6), loliolide (7), dehydrovomifoliol (8), (3,5,6,7)-3,5,6-trihydroxy- 7-megastigmen-9-one (9), (6,7,9)-9-hydroxy-4,7-megastigmadien-3-one (10), vomifoliol (11), 8,9-dihydro-8,9- dihydroxymegastigmatrienone (12), aurantiamide acetate (13), aurantiamide (14), and aurantiamide benzoate (15). Compound 2 showed the most potent cytotoxic activities against the A549 and SMMC-7721 cell lines, with IC50values of 23.62 and 27.46 µmol/L, respectively.All compounds are isolated fromgenus for the first time, including four triterpenoids (1～4), eight monoterpenoids (5～12) and three alkaloids (13～15). Lupane triterpenoids may be antitumor constituents fromvar..

var.(Buch.ex DC.) Forman; terpenoids; cytotoxic; lupane triterpenoids; betulin; aurantiamide

R284.1

A

0253 - 2670(2022)18 - 5607 - 06

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.18.003

2021-04-26

河南中医药大学省属高校基本科研业务专项（2014KYYWF-QN26）；河南中医药大学科技创新人才（2016XCXRC01）；河南省科技攻关（192102310438）；河南省中医药科学研究专项（20-21ZY1039）

潘如意（1998—），女（汉族），硕士研究生，从事天然抗肿瘤活性物质研究。Tel: 18837138537 E-mail: 18837138537@163.com

孙彦君（1978—），女（汉族），教授，硕士生导师，从事天然抗肿瘤活性物质研究。Tel: (0371)65962746 E-mail: sunyanjunily@126.com

冯卫生（1960—），男（汉族），教授，博士生导师，从事中药活性成分研究。Tel: (0371)60190296 E-mail: fwsh@hactcm.edu.cn

[责任编辑 王文倩]