环状R N A的生物学功能及其与中枢神经系统疾病关系的研究进展

武世萍，俞坤 综述，王满侠 审校

兰州大学第二医院神经内科，甘肃 兰州 730030

环状RNA（circular RNA，circRNA）是一类天然、高度保守、具有闭合环状结构、长链非编码的内源性RNA分子，其长度从100～4 000个碱基不等，缺少5′端帽结构和3′端多聚腺苷尾结构［1-2］。1976年，SANGER等［3］通过显微镜下对植物类病毒的观察，首次描述了这种共价闭合环状RNA分子，由此开启了circRNA的研究。后续研究陆续发现circRNA广泛存在于真核细胞生物和人体细胞中［4-5］。起初人们认为circRNA是异常剪切的副产物，因此未对其予以重视，致使circRNA的发展十分缓慢。直至本世纪，高通量RNA测序（RNA-seq）技术和生物信息技术的飞速发展引起了者对circRNA的关注，人们发现circRNA是许多真核生物蛋白编码基因的常见输出，并发现一部分circ-RNA在机体中有明确的生物学功能［6］。CircRNA一旦产生，即为高度稳定的转录本，会自然抵抗外切酶的降解，其半衰期超过48 h，导致circRNA在细胞质中逐渐积累。基于circRNA在血液和其他生物体液中的独特稳定性，其显示出作为许多疾病的预后生物标志物的巨大潜力［7］。目前已有多项研究表明，circRNA在癌症、自身免疫性疾病等疾病中可作为疾病进展和预后的生物标志物，并有可能为上述疾病的治疗提供新的靶点［8-9］。近年来相关研究亦发现，circRNA通过特定信号通路与多发性硬化（multiple sclerosis，MS）、阿尔兹海默病（Alzheimer disease，AD）、帕金森病（Parkinson disease，PD）等中枢神经系统（central nervous system，CNS）疾病的发病过程密切相关［8，10］。本文对circRNA的生物生成、生物学特性、生物学功能及其与CNS疾病关系的研究进展作一综述，以期为CNS疾病的诊治提供新的思路。

1 CircRNA

1.1Ci r cR NA的形成及影响因素 大部分circRNA是由前体mRNA（pre-mRNA）通过特殊的反剪切机制产生的，下游剪接供体与上游剪接受体连接，引起pre-mRNA的环化，这通常通过内含子重复序列实现，这些序列彼此成对配对，并使插入的剪接位点更接近，利于circRNA产生［10］。外显子跳跃、内含子配对驱动的环化和RNA结合蛋白驱动的环化是目前circRNA产生的主要机制［11］。①外显子跳跃：又称套索驱动环化，pre-mRNA下游外显子的3′端剪接供体与上游外显子的5′端剪接受体共价结合，形成套索结构，剪除内含子后即形成circRNA；②内含子配对驱动的环化：基于内含子侧翼内部的反向互补匹配（reverse complementary matches，RCMs），侧翼内含子之间的碱基配对促进发夹形成，使外显子的5′和3′端在空间上接近，并诱导“头-尾”剪接形成circRNA；③RNA结合蛋白（RNA-binding-proteins，RBPs）驱动的环化：一些RBPs通过与侧翼内含子特定序列结合，促进circRNA的产生，如果蝇肌盲蛋白（splicing factor muscleblind，MBL）、RBM20蛋白、选形成受多种因素的影响。RNA聚合酶（polymerase，pol）的延伸率与剪接的效率和circRNA形成相关［13］。ZHANG等［14］研究发现，RNA pol的快速延伸可能会促进长侧翼内含子的反向互补序列配对进行反剪接，从而促进circRNA的形成。IVANOV等［15］发现，作用于RNA的蛋白质腺苷脱氨酶（adenosine deaminase，ADAR）可通过将双链RNA分子内的腺苷残基转化为肌酐分子来下调双链RNA分子产生，从而减少环状RNA的形成。ERRICHELLI等［16］研究证明，RNA结合蛋白FUS是一种新的能够影响circRNA产生调节因子。综上，circRNA的生物生成过程是极其复杂，影响其产生的体内因素也多种多样。

1.2Ci r cR NA的分类 根据circRNA来源不同，可将其分为3类：外显子来源的circRNA（exonia circ-RNA，ecircRNA）、内含子来源的circRNA（intronic circ-RNA，ciRNA）、外显子与内含子共同来源的circRNA（exonia-intronic circRNA，EIcircRNA）［17］。其中ecircRNA包括所有由1个或多个外显子组成的circ-RNA，是circRNA中最大的一类，主要存在于细胞质中；CiRNA由两个或多个连接的内含子组成；EIcircRNA由外显子与内含子共同组成，二者多位于细胞核内。ciRNA、ecircRNA和EIcircRNA存在部位的差异提示三者在功能上有一定差异［18-19］。

1.3Ci r cR NA的生物学功能

近年来，关于circRNA生物学功能的研究是该领域的研究热点，许多研究结果已发表，但绝大多数已知circRNA的功能是不明确的［10］。最众所周知的功能是circRNA作为微小RNA（microRNA，miRNA）“分子海绵”发挥生物学功能［8］，circRNA还可通过调控转录过程及自身翻译为蛋白质等方式发挥功能［8］。

1.3.1作为miRNA“分子海绵”研究表明，在circ-RNA上存在miRNA特异性结合位点，circRNA可竞争性结合miRNA影响miRNA的剪接和转录。最为典型的例子是来源于人类反义长链非编码RNA的小脑变性相关蛋白1反义转录物（antisense to the cerebellar degeneration-related protein 1 transcript，CDR1as），也称为ciRS-7，ciRS-7含有超过70个进化保守的miR-7结合位点，并以miR-7依赖的方式与mi-RNA效应蛋白Argonaute结合［20-21］，circRNA结合后可强烈抑制miR-7活性，在斑马鱼中，人ciRS-7的表达可削弱中脑发育，类似于敲除miR-7［22］。另一方面，ciRs-7不仅与miR-7结合，还具有与miR-671结合的位点，引起的生物学效应却与miR-7截然相反［23］。另外，睾丸特异性circRNA性别决定区Y（sex determining region Y，SPY）存在16个miR-138结合位点，可导致miR-138基因表达明显下调［24］。CircHIPK3也可直接结合miR-124，并抑制其活性，导致细胞生长受阻［25］。CircRNA作为miRNA“分子海绵”的研究是阐明circRNA功能的关键部分，应加强关注与研究。

1.3.2参与转录及转录后调控 转录及转录后调控是circRNA另一个较为重要的功能，通常由位于细胞核内的ciRNA和EIcircRNA参与。在拟南芥研究中发现，来自SEPALLATA3（SEP3）基因第6外显子的circRNA可与其同源DNA位点强烈结合，形成RNA：DNA杂交环，导致转录暂停，引起花表型的改变，该过程证明circRNA与宿主基因选择性剪接密切相关［10，26］。ZHANG等［27］发现，ci-ankrd52可在转录位点上积累，并正向调控RNA pol转录效率，提示环状RNA与RNA pol延伸的机制有关。LI等［28］报道，环形真核翻译起始因子3亚基J（circular eukaryotic translation initiation factor 3 subunit J，circEIF3J）和环形多聚腺苷酸结合蛋白相互作用蛋白2（circular polyadenylate-binding protein-interacting protein 2，circPAIP2）可与U1小核核糖核蛋白（small nuclear ribonucleic proteins，snRNA）形成复合物，进而促进基因表达。CircRNA也可影响蛋白质的翻译［8］。HOLDT等［29］的研究提示，circANRIL与核糖体组装必须因子Pescadillo同系物1（Pescadillo homologue 1，PES1）结合，可削弱60S核糖体成熟过程中pre-rRNA处理过程，进而减缓蛋白质的生成。ABDELMOHSEN等［30］研究发现，高水平circPABPN1可抑制RNA结合蛋白HuR与PABPN1 mRNA的结合，影响circPABPN1亲本线性mRNA的表达，最终导致较少蛋白质生成。此外，DU等［31］发现，circFoxo3还可调控蛋白质亚细胞定位。综上，circRNA参与转录及转录后调控涉及位点多，是较为复杂的过程。

1.3.3被翻译为蛋白质 虽然circRNA是非编码RNA，但研究发现，部分circRNA可被翻译为蛋白质。ABE等［32］证明，circRNA在活的人类细胞中可通过滚环扩增（rolling circle amplification，RCA）机制被翻译，产生丰富的蛋白质产物。PAMUDURTI等［33］也发现，circRNA序列可与包括终止密码子在内的核糖体结合，并进一步翻译为蛋白质。此外，相关研究表明，天然circRNA翻译产物具有多种功能［34］，这将会拓宽未来研究的思路和方向。

1.3.4与蛋白质结合发挥功能 CircRNA也通过与蛋白质结合发挥生物学功能。CircFOXO3通过与周期蛋白依赖性激酶2（cyclin-dependent kinase2，CDK2）和周期蛋白依赖性激酶抑制剂1（cyclin-dependent kinase inhibitor 1，p21）形成三元复合物可抑制细胞周期进程［35］。CircAmotl1可与3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1（3-phosphoinositide-dependent protein kinase-1，PDK1）和AKT丝/苏氨酸激酶1（AKT serine/threonine kinase 1，AKT1）结合，使AKT1磷酸化，对心血管疾病起预防作用［36］。

2 CircRNA与CNS的发育

研究发现，大脑中circRNA的表达在机体所有器官中最高，且随着年龄增长而积累，在啮齿动物和人类大脑中已鉴定出超过10 000种不同的circ-RNA，如circRims2、circTulp4、circElf2等，提示神经元基因更多地编码为circRNAs［37］。在脑组织不同发育阶段，circRNA的分布不同，在神经元及突触中较其他区域富集程度更高［37-39］。研究表明，circRNA在神经元分化和成熟的不同时期表达增高，尤其在出生后发育阶段，且其表达模式在小鼠、猪和人之间高度保守［7，38］，提示circRNA很可能参与神经元分化过程。新的研究进一步表明，circRNA表达在神经发育过程中发生了时间和空间上的变化以及动态改变［23］。VENφ等［40］对胎猪发育过程中6个时间点的5个脑组织中circRNA的表达进行了检测，发现circRNA表达的数量和复杂性在妊娠第60天的皮质中最为显著。RYBAK-WOLF等［7］研究发现，circRNA在神经元分化过程中总体上调，但在不同的神经分化阶段，circRNA上调水平和类型出现差异。时空差异性表明，在不同的神经元组织和发育过程中，circRNA可能发挥重要作用。CircRNA在突触的高表达表明circRNA在突触的产生和功能方面具有重要意义。YOU等［38］研究发现，circRNA在突触形成初期表达水平即明显增高，持续上调的circ-RNA是由编码具有突触相关功能的蛋白质基因位点产生的，并发现在成熟神经网络建立过程中，突触相关基因来源的circRNA较胚胎时期增高更明显，如源于Homer1的circHomer1_a在突触可塑性过程中表达水平增高，参与突触后密度的调控。这与VENφ等［40］的研究结果相似。研究还推测，circ-RNA在运输突触形成相关的RNA和蛋白质等方面也发挥作用［7］。由于circRNA高度保守，人类大脑皮层突触密度比小鼠增加了4倍，因此在人类大脑中可监测到更高水平的circRNA［41］。此外，已有研究表明，miRNA在突触的形成、稳定和可塑性方面发挥重要作用［42］，因此学者们推测，circRNA很有可能通过“分子海绵”的方式间接调控突触发生［43］。综上，circRNA在神经发育过程中表达水平改变，提示它们可能在神经增殖和分化过程中发挥重要作用，但circRNA如何具体影响神经发育有待进一步研究。

3 CircRNA与CNS疾病

3.1Ci r cR NA与MS MS被认为是一种CNS的自身免疫性疾病，自身反应性免疫细胞识别髓鞘抗原导致脱髓鞘和轴索损伤，神经退行性因素亦占重要地位［44］。MS是目前导致青壮年神经系统残疾最常见的非创伤性原因，发病机制尚未完全阐明［17］。近年来，表观遗传因素与MS的关系是研究的热点，其中最重要的是一组miRNAs的发现，这些单链非编码RNA分子可调节细胞因子和生长因子的表达，已被认为是MS的生物标志物和治疗靶点［45-46］。最近研究发现，miRNAs在MS中的调控作用受circRNA的影响［47］。Th17细胞是效应T细胞的一个亚群，是MS发病机制中一个公认的关键因素。DU等［48］通过对实验性自身免疫性脑脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE）模型的研究发现，miR-326的过表达会导致Th17细胞数量增加和EAE小鼠残疾程度加重，而circRNA has_circ_0000218已被证明可作为miR-326的“分子海绵”［46］。但另有研究发现，MS患者体内miR326与has_circ_000-0218表达数量并非呈正相关［49］。另外，IPARRAGUIRRE等［50］对MS患者外周血单核细胞circRNA的研究发现，定位于15号染色体ANXA2基因的circ_0005402和circ_0035560较健康对照组表达下降，提示二者可作为该疾病的生物标志物。上述研究提示，circRNA在MS的诊治中是一个很有潜力的新型生物标志物，可为MS靶向治疗提供新的思路。

3.2Ci r cR NA与A D AD是一种最常见的进行性神经退行性疾病，是由于大脑中淀粉样蛋白-β（β-amyloid，Aβ）或过度磷酸化Tau蛋白的沉积而导致突触、神经元体细胞和轴突受损而引起的［51］。相关研究已发现，AD患者大脑中存在大量差异表达的circRNA，在AD患者细胞和动物模型中还观察到敲除或过表达某些circRNA可减轻AD样病理表现，表明circRNA很可能参与调控AD病理改变［52-53］。ZHAO等［54］研究发现，AD患者大脑新皮层和海马中ciRS-7丰度显著降低，约为年龄匹配对照组的0.18倍，推测ciRS-7介导的“分子海绵”的缺陷引起miRNA-7的增加，从而驱动miRNA-7敏感的mRNA靶蛋白泛素结合酶E2A（ubiquitin-conjugating enzyme E2A，UBE2A）选择性下调，而UBE2A对清除神经退行性疾病产生的淀粉样肽等细胞毒性分子至关重要，与AD发病密切相关［55］，该研究提示，失调的ciRS-7——miRNA-7——mRNA——UBE2A信号通路对解释AD发病过程具有一定意义。另外，SHI等［56］报道，ciRS-7还可通过抑制核转录因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）的翻译，诱导其胞质定位，间接下调泛素羧基端水解酶L1（ubiquitin carboxylterminal hydrolase L1，UCHL1）的表达，促进β淀粉样前体蛋白（β-amyloid precursor protein，APP）和β位点APP-裂解酶1（β-site APP-cleaving enzyme 1，BACE1）的降解，BACE1对APP的增强裂解是AD的主要致病过程，其水平下降具有抗AD作用，该研究表明，ciRS-7在AD发病过程具有潜在的神经保护作用。LU等［57］在小鼠实验中观察到circHDAC9可充当miR-138海绵，降低miR-138的表达，并逆转由miR-138诱导的沉默信息调节因子相关酶1（sirtuin 1，Sirt1）活性抑制和过量Aβ产生。LU等［57］在临床研究中也发现，AD患者和轻度认知障碍患者血清中circHDAC9均降低，且与简易智力状态检查（minimental state examination，MMSE）评分相关，该研究提示，circHDAC9-miR-138-Sirt1通路与AD的发生发展也相关。此外，hsa_circRNA_405619和hsa_circ-RNA_000843的上调也与AD患者中APP的过表达相关［58］。综上，circRNA可通过miRNA海绵或RBP途径影响AD的多种病理改变与疾病进程，基于目前研究，差异表达的circRNA在AD发病过程中具有作为生物标记物的潜力，且开发以内源性circRNA为核心的AD靶向药物，可能改变目前AD药物治疗方案单一的情况。

3.3CircR NA与P D PD是一种常见的神经退行性疾病，病理改变为黑质致密部多巴胺能神经元的进行性丧失，引起运动迟缓、静止性震颤、肌张力增高以及姿势步态障碍等症状［59］。特异性circRNA已被发现与PD的发生有关［60］。α-突触核蛋白（αsynuclein，α-syn）可通过NF-κB信号通路参与氧化应激和1-甲基-4-苯吡啶诱导的细胞凋亡，是PD致病的关键蛋白。2009年，JUNN等［61］研究发现，miR-7是唯一匹配所有特征，能够调节α-syn表达的miRNA，并发现miR-7可通过与α-syn mRNA的3′端非翻译区（3′-untranslated region，UTR）结合下调α-syn的表达，从而保护细胞免受氧化应激。近年来研究进一步发现ciRs-7、miR-7和α-syn形成的信号通路与PD发病密切相关，miR-7被ciRs-7通过“分子海绵”负调控，引起α-syn的蛋白质水平改变［21，46］。综上，完全明确ciRs-7在PD中的具体作用机制尚需更深入的研究，但将ciRs-7作为PD生物标志物是可行的，另一方面也应注意miR-7可能是PD和其他与α-syn有关疾病潜在的治疗靶点。

3.4CircR NA与C N S肿瘤 神经胶质瘤是目前最常见的CNS肿瘤，因其较差的预后，明确其潜在发病机制以探寻有效治疗靶点十分重要。目前较多研究表明，ciRs-7在神经母细胞瘤和星形细胞瘤中高表达。LI等［62］在神经胶质瘤细胞中检测出高表达的circRNA hsa_circ_0046701，并试图验证miR-142-3p、hsa_circ_0046701和整合素亚基β8（integrin subunit beta 8，ITGB8）之间的相关性，结果发现，hsa_circ_0046701可充当miR-142-3p的“分子海绵”，沉默的hsa_circ_0046701可上调miR-142-3p，导致ITGB8的下调，最终抑制细胞的增殖与侵袭，该研究结果表明，由hsa_circ_0046701、miR-142-3p和ITGB8构成的信号通路可能在神经胶质瘤的发病和发展中起重要调节作用。LI等［63］研究还发现，hsa_circ_0007534可通过抑制miR-761来促进ZIC5基因表达，从而在神经胶质瘤中起癌基因的作用。此外，hsa-circ-0012129、hsa_circ_0074362及circ-SHPRH也在胶质瘤发病机制中具有调控作用［64-66］。上述circRNA参与的调节环可能为未来神经胶质瘤的靶向治疗提供理论基础。

3.5Ci r cR NA与C N S其他疾病 朊病毒病又称为传染性海绵状脑病（transmissible spongiform encephalopathy，TSE），是一种与痴呆相关的神经退行性疾病，由正常细胞表面糖蛋白（PrPC）转化为修饰异构体（PrPSC）引起的［67］。SATOH等［68］建立了表达PrPC的HEK293细胞系，发现小脑变性相关自身抗原（cerebellar degeneration-related autoantigen，CDR34）基因表达上调，而CDR34基因可通过非正常的反剪切机制形成CDR1as，提示CDR1as很有可能参与TSE的发生发展。颞叶癫痫是最常见的局灶性癫痫，易产生耐药性，抗癫痫药物治疗后期效果不佳，因此，寻找新的治疗方法十分必要。LI等［69］研究发现，颞叶癫痫组和非颞叶癫痫组差异表达的circRNA多达442个，其中188个上调，254个下调，生物信息学分析表明，circ-EFCAB2和circ-DROSHA可能是颞叶癫痫潜在的生物标志物与治疗靶点。CUI等［70］研究发现，抑郁症患者外周血单核细胞中hsa_circ-RNA_103636表达的改变是该病诊断和治疗有效的分子。CHEN等［71］在自闭症谱系障碍（autism spectrum disorders，ASD）患者脑组织中发现60余个circRNA，并发现ASD患者皮层样本中的circRNA与miRNAs和mRNA有一定相关性，支持了circRNA失调在ASD病理生理中的作用。另外，在创伤性脑损伤（traumatic brain injury，TBI）、缺氧缺血性脑损伤（ischemia-hypoxia brain damage，HIBD）及肌萎缩侧索硬化症（amyotrophic lateral sclerosis，ALS）等疾病模型或患者中也发现了不同数目差异表达的circRNA［46］，提示circRNA也可能参与这些疾病的发病过程。

4 小结与展望

目前的研究结果已有效拓宽了对circRNA生物形成、生物学功能及其与CNS关系等方面的认识。在CNS发育过程中，相关circRNA表达增高，并表现出时空差异性，在CNS疾病中，circRNA也通过“分子海绵”等方式在circRNA-miRNA-mRNA通路的相关环节进行调控，对疾病的发生发展发挥作用。尽管对circRNA的研究尚处于起步阶段，circRNA与CNS和CNS疾病的关系仍待明确，特别是对于它们在不同组织和生理病理状态下生物起源的调控及其发挥的生物学功能了解还较少［17，38］，但这些分子高稳定性、高保守性及组织表达特异性等特性使其有望成为神经系统疾病潜在的生物标志物，其作用通路的研究也将有助于靶向治疗的发展。综上所述，针对circRNA和circRNA与CNS疾病关系的研究具有深远意义，将帮助我们更好地理解神经系统发育过程以及CNS疾病的异质性，并可能为探索有效的疾病治疗方法提供良好的思路。