高分子聚合物用于siRNA递送系统的研究进展

王富喜 邓宏图 王滨

滨州医学院附属医院药学部，滨州 256600

RNA干扰技术是借助分子生物学技术将外部治疗性核酸分子例如小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）导入患者病原部位的靶细胞内，通过目的基因的沉默来对引发疾病的缺陷或者异常基因进行修正，从而实现预防或治疗特定疾病的一种新兴生物治疗技术，目前主要针对某些病毒引发的机体感染、人体的部分癌症以及多种遗传引发的病症等［1］。siRNA 药物相比于传统药物，在某些疾病治疗上展现出巨大优势，即通过序列设计靶向基因，siRNA 可以达到治疗疾病的目的，并且其合成工艺相对于抗体药物更为简单［2］。siRNA 的靶点特异性强，对于同一家族的激酶来说，小分子抑制剂往往会产生脱靶效应而产生不良反应，而使用siRNA 作为药物，通过对序列的精确设计，可以使脱靶产生的可能性尽可能地降低［3］。siRNA 的优点是高效和特异性，但由于siRNA 进入体内后的不稳定性，因此在siRNA药物的研发中其载体的构建越来越受到关注，以期提高siRNA 药物稳定性及靶向性。本文将从siRNA 体内递送存在的影响因素及递送siRNA 的高分子聚合物载体的研究进展进行综述。

siRNA体内递送的障碍

虽然RNA 干扰等基因技术为临床疑难杂症的治疗提供了不同于以往治疗手段的新策略，但是这些策略无一例外均需要基因体内递送。只有将治疗基因有效递送至患者病灶细胞内进行表达，才能达成预期治疗目标，体外基因导入体内便要克服递送过程中诸多的递送障碍，临床上多遇见的基因递送障碍有以下几种。

1、核酸酶降解

由于核酸携带负电荷以及自身尺寸大小限度，故而很难以游离方式直接通过细胞膜进入细胞内。而电穿孔、基因枪或直接注射靶细胞等方式虽然可以直接将目的基因注进核酸，然而，这些技术在体内传递方面存在局限性，如缺乏组织穿透、细胞和组织损伤诱导以及往往转染效率很低。因此，需要更谨慎和高效的方法来实现siRNA 向肿瘤细胞的递送。当靶部位不能局部确定时，通过静脉给药是首选的策略。同时，体内存在很多核酸酶，这些酶能够短时间内降解人体内部循环中的游离核酸［4-5］。为解决核酸被破坏问题，化学修饰的主干或寡核糖核苷酸的碱基已被用来保护siRNA，而不损害其结合靶信使RNA（mRNA）的能力，临床研究发现，核酸带负电荷的磷酸主链与带正电的阳离子分子可以以静电相互作用而发生络合生成核酸络合物，这种结构的络合可以使得络合物电荷呈近电中性，同时核酸分子结构被压缩，从而改善核酸被酶降解［6］。

2、细胞摄取效率

基因递送过程中，从细胞外进入细胞内应跨越一层含有类型数量大的糖蛋白的磷脂双分子层结构细胞膜，细胞的摄取效率便往往影响了基因递送的疗效［7-9］。脂质体、高分子载体等包载siRNA 药物载体纳米颗粒进入细胞内主要借助吞噬和胞饮进行，不同纳米粒（nanoparticles，NPs）进入细胞的方式均各不相同，应该选择合适纳米材料作为选择基因递送载体材料，同时对纳米材料进行相应修饰，利用靶细胞所处微环境差异来提高细胞摄取效率［10-11］。

3、内涵体逃逸障碍

核酸络合物进入细胞后，被囊泡包裹会和细胞器融合，形成内吞小泡，内吞小泡会逐步从早期内涵体转化为晚期内涵体，直至成熟为溶酶体，这时溶酶体内环境的pH 值下降、消化酶类增加，为了使核酸络合物免于被降解而失去疗效，就要使核酸络合物及时在溶酶体降解之前从内涵体从中逃逸出来并在细胞质中释放［12-13］。

递送siRNA的高分子聚合物载体

目前研究常见的基因表达载体主要有利用病毒来做载体和不利用病毒所制备的载体两种类型。（1）病毒载体：病毒载体是将要导入的治疗基因包裹在自然存在的病毒的外壳内，利用自然存在的病毒对人细胞感染性来将治疗基因注入人体靶细胞。实验中多用的病毒载体有逆转录型的病毒载体、腺病毒类的载体等［14-16］；（2）非病毒载体：非病毒载体是指借助高分子材料实现基因递送，常用的该类载体有脂质体、树枝状大分子、非天然阳离子聚合物、天然多糖等［17-22］。

阳离子聚合物目前已是一类应用最为广泛的非病毒型的基因载体，是络合核酸如siRNA 的最有吸引力的生物材料，其作为基因载体的优势较为明显：（1）来源丰富，结构多样；（2）容易修饰和多功能化；（3）生物相容性与体内可降解性较好等。直至如今，现有很多的阳离子聚合物被实验发掘可在基因递送中应用，并在进行进一步的研究。

1、聚乙烯亚胺（polyethyleneimine，PEI）

PEI 是一种聚合物载体，用于递送核酸的研究较多。PEI是一种由胺基的重复单位和两个碳脂族CH2CH2间隔体组成的水溶性高分子聚合物，因其结构中含有许多氨基基团，呈现出高密度的正电荷，具有强烈的“质子海绵效应”，促使其在一定pH 范围内具有更好的络合作用和pH 缓冲能力，使核酸免受溶酶体的降解，这也是其转染效率较高的机理［23-24］。PEI 的独特性能使其成为广泛应用的 siRNA 递送载体。但PEI 的一个显著缺点是细胞毒性问题，其转染效率相对来说虽然较高，但随着分子量的增加和分支结构的增加，PEI 以线状和分支状的形式存在，其表现出的细胞毒性也有所增加。目前可知，线性或低分子量的PEI 与分支状PEI 相比，转染效率好，毒性低。也有报道称，由于低分子量的PEI供siRNA结合的位点较少，结构稳定性无法在酸性环境下维持，使PEI 作为递送载体的能力受到很大限制［25］。为减少其毒性，在不改变其物理和化学性质的基础上，对PEI 进行各种修饰，以优化已与壳聚糖、透明质酸、环糊精、聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）等其他聚合物结合形成能保护siRNA 的NPs，形成促进内涵体逃逸的PEI 递送载体。

壳聚糖是一种可生物降解、生物相容性好、无毒的聚合物，但对siRNA 转染效率低。然而，壳聚糖与PEI 的偶联可以缓解此缺陷。例如，Huh 等［26］研发的具有较好的生物相容性并可生物降解的乙二醇壳聚糖聚合物（GC）-PEI-siRNA NPs，其在体内表现出很强的肿瘤富集及靶向下调目标mRNA 的效应。Zhang 等［27］开发了一种双靶向壳聚糖-PEI 纳米系统TCPL/siRNA/PPF NPs，同时负载抗肿瘤药物氯尼达明及siRNA。包裹的siRNA 靶向凋亡抑制蛋白Bcl-2，同时纳米粒被一层聚乙二醇-聚（丙烯酸）-叶酸［PEG-Poly（acrylic acid）-folic acid］覆盖，以延长循环、增强肿瘤细胞靶向性，同时载体将线粒体靶向配体三苯基膦加入壳聚糖-PEI 聚合物中，在体外也显示出了显著的抗肿瘤效应。

HA 是一种由D-葡萄糖醛酸与N-乙酰D-葡萄糖胺（NAG）二糖单元交替组成的多糖，其是细胞外基质（ECM）和滑膜液的组成部分，是带负电荷的、可生物降解的、无毒的、无免疫原性的，并已被用于靶向CD44，显示出了显著的抗肿瘤效应。Ganesh等［28］开发了HA-PEI/PEG NPs，携带靶向SSB 和PLK1 蛋白的siRNA，在异种移植瘤模型中显示了siRNA 具有体内活性。此外，siRNA 的沉默效率高度依赖于肿瘤的血管化，这表明肿瘤部位的积累并不仅仅是由靶向配体HA介导的。

CD 是一个由α-1，4 糖苷键连接的葡萄糖亚基组成的大环环寡糖。β-CD 纳米系统的特点是内部疏水，外部亲水，它们被用于增强负载疏水药物的药代动力学特性，其与siRNA 已成为协同药物传递的理想候选载体。有研究开发了一种吸附在金纳米棒上的CD-PEI偶联物，用于多西他赛（docetaxel，DTX）与靶向p65 蛋白的 siRNA 共同递送，结果表明，p65 抑制核因子-κB 通路及其下游级联反应，增强了DTX效应，抑制了体内肿瘤的生长［29］。

2、多聚赖氨酸（poly-L-lysine，PLL）

与PEI 类似，PLL 也是被广泛用于核酸传递的纳米载体。PLL 比PEI 具有更好的生物相容性和生物降解性。然而，PLL/siRNA 和PLL-PEG/siRNA 多聚物更容易与血清蛋白相互作用，降低了其沉默靶mRNA 的能力。研究表明，血清白蛋白和其他聚阴离子可以与siRNA 竞争结合PLL，导致颗粒不稳定性和siRNA 解体。有趣的是，锁相环衍生物能够通过提高血清稳定性来缓解这一缺点。例如，聚己内酯（polycaprolactone，PCL）已 被 用 于 开 发 一 种 新 型PEG-PCL-PLL 聚合物，它能够结合siRNA 并形成胶束。该制剂的体外沉默效率与lipofectamine 2000 相似，优于PEI［30］。

PLL 还利用其优异的光热特性与生物相容性与黑色素结合。黑色素在近红外照射下产生热量，这可能被用来促进siRNA 内涵体逃逸。生成的黑色素-PLL 聚合物负载以存活蛋白（survivin）为靶点的siRNA，在体内和体外均对4T1 肿瘤细胞生长有很强的抑制作用，同时与对照组相比，能够明显抑制小鼠肺转移瘤的进展［31］。研究表明，Wang等［29］开发了一种新型三嵌段聚合物，由聚天冬氨酸［N-（N’，N’-二异丙基氨基乙基）］（PAD）与PLL-PEG 结合组成。PAD 用于赋予聚合物的pH 值敏感性，从而增强siRNA 和阿霉素向肿瘤细胞的传递。载体通过负载抗肿瘤药物阿霉素，以及靶向Bcl-2 的siRNA 诱导肿瘤细胞凋亡。HepG2/阿霉素荷瘤小鼠的生物分布分析显示，注射6 h 后肿瘤部位出现NP 积累，24 h 时达到最大值，持续时间长达48 h。此外，负载阿霉素/siRNA 治疗组与对照组相比，PAD-PEG-PLL NPs 能够抑制荷瘤小鼠的肿瘤生长并增加其生存时间，同时体外分析显示，治疗后Bcl-2 和Ki67 的表达减少，提示诱导细胞凋亡，减少细胞增殖，从而控制了荷瘤小鼠的肿瘤生长［32］。

3、聚乳酸-乙醇酸（polylactic-co-glycolicacid，PLGA）

PLGA 是一种安全的高分子聚合物，具有生物可降解性，广泛用于包括siRNA 递送在内的药物的递送。在细胞水平上，PLGA 容易通过内吞作用穿透细胞膜或促使siRNA进入细胞，并迅速释放到目标位置，直到溶酶体降解siRNA。但有报道称，单独与siRNA 结合，可能受siRNA 阴离子电荷和极性的影响，PLGA 的封装效率、药物释放和转染效率都受到限制［30］。利用经过PEI 修饰的PLGA 纳米微粒，提高了siRNA 的包封效率和释放度，提高了siRNA 在聚合物中的保留性，促使siRNA释放到细胞质中［33］。

siRNA 药物是目前受到重点关注的新型药物。理论上，它能沉默任何疾病相关基因的表达。这使其成为治疗各种恶性难治性疾病（包括肿瘤等重大疾病）的希望。但它同时也存在血浆稳定性差、生物利用度低等问题。这已成为制约其应用的致命性缺点。如何将其有效地递送至体内、提高其生物利用度，是目前亟须解决的问题，而寻找优良载体、合理设计递送体系至关重要。目前关于siRNA 的递送系统的开发研究越来越多，随着研究的不断深入，相信在不久的将来会设计出更多的siRNA 高分子聚合物递送载体，在治疗肿瘤疾病及多种疾病方面会有很大的贡献。