基于microRNA探讨中医药在骨关节炎软骨细胞衰老中的调控作用*

张涛，严隽陶，叶斌

1.上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院，上海 200437； 2.上海市第三康复医院，上海 200436

骨关节炎是一种常见的滑膜关节疾病，其主要特征是软骨退化以及骨过度生长等。随着人口老龄化及肥胖症、关节外伤患者的增加，骨关节炎的发病率逐年升高，给家庭和社会带来了巨大的负担[1]。据统计，全世界骨关节炎的患病人数已超2.5亿[2]。软骨细胞衰老在骨关节炎的发生发展过程中发挥了重要作用[3]。骨关节炎的发展与关节组织中衰老软骨细胞数量的增加有关[4]。衰老软骨细胞可以通过增加衰老相关β半乳糖苷酶(senescence-associated β-galactosidase，SA-β-gal)表达、细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclin-dependent kinases，CDK)抑制剂p16INK4a积累、分泌衰老相关的分泌表型(senescence-associated secretory phenotype，SASP)并引起DNA损伤反应等，破坏软骨形态及结构[5]。同时，作为基因表达的调节因子，microRNA在骨关节炎软骨中被异常调节，并在软骨细胞的衰老过程中发挥调控作用，影响疾病的进展[6]，这意味着通过调控特定的microRNA影响软骨细胞的衰老过程，可能是一种有效的治疗方法。因此，全面了解软骨细胞衰老相关microRNA及其机制对骨关节炎的研究和治疗有着重要意义。

现有研究多集中在microRNA调控软骨细胞的增殖、凋亡、自噬等方面，对软骨细胞衰老的调控研究较少，且缺少相关文献综述。故本文介绍了在骨关节炎软骨细胞衰老中研究较多的microRNA及相关信号通路的作用机制，并对中医药研究现状进行了综述。

1 软骨细胞衰老

1.1 衰老软骨细胞的产生机制软骨细胞衰老可能由线粒体功能障碍、机械载荷过大、复制衰老、氧化应激以及DNA损伤等多种因素导致，继而引起端粒侵蚀、p53、CDK抑制剂p21和p16INK4a表达增加，通过线粒体功能障碍增加活性氧(reactive oxygen species，ROS)生成以及衰老相关的异染色质增加[7]。具体言之，软骨细胞会随着时间的推移而衰老和衰退。研究显示，骨关节炎的发病率与年龄增长呈显著的正相关，而由年龄增长导致的软骨细胞衰老是其主要发病机制之一[8]。除了增龄，创伤后的软骨及细胞外基质修复也会使得软骨细胞的增殖潜力被激活，加速软骨细胞衰老，刺激软骨退化[9]。此外，关节的异常机械载荷和剪切应力以及高热量、低营养饮食等不良生活方式也可使软骨细胞衰老的过程过早启动[10]。

1.2 衰老软骨细胞相关生物标志物软骨细胞衰老时会发生特定的形态和分子变化。在形态上，衰老会使软骨细胞趋于扁平和增大，并积累应激颗粒和液泡。而在分子变化方面，软骨细胞的衰老会引起SA-β-gal表达的增高。SA-β-gal是一种糖苷水解酶，可作为哺乳动物组织中识别衰老细胞的生物标志物，其在衰老细胞中活性的升高可能是由于细胞中某些溶酶体酶活性的提高[11]。实验证实，SA-β-gal阳性染色软骨细胞在骨关节炎软骨组织中增加，且与疾病严重程度成正比[12]。

除此之外，p53/p21/视网膜母细胞瘤蛋白(retinoblastoma，Rb)及p16INK4a/Rb通路相关基因也是软骨细胞衰老的生物标志物。虽然引起细胞衰老的上游调控通路和机制不尽相同，但其最终效应通路基本围绕这两条通路。DNA损伤后，染色质结构发生的改变会磷酸化p53，激活p53，上调其下游靶基因p21的转录，抑制CDK2的活性进而抑制Rb蛋白去磷酸化，引起软骨细胞G1期周期阻滞，导致细胞衰老[13]。而p16作为一种与年龄高度相关的生物标志物，其细胞内检测水平已被证实可以作为细胞衰老和确定生物体生物学年龄的生物标志物[14]。p16诱导细胞衰老的机制与p21相似，通过阻断CDK4/6，阻止细胞周期抑制蛋白Rb的下游抑制作用，从而诱导细胞衰老。研究表明，软骨细胞p21或p16的高表达可以引起细胞外基质(extracellular matrix，ECM)蛋白的减少，同时上调SASP表达，导致软骨破坏[15]。

但值得注意的是，除了受细胞衰老的影响，SA-β-gal还受细胞自噬和溶酶体活性等其他变化的调控，因此不能单独将其作为反映细胞衰老的生物标志物[16]。p21、p16基因虽然是软骨细胞衰老的标志物，但有研究证实，p21、p16基因与骨关节炎并无直接因果关系，诱导衰老软骨细胞分泌的SASP才是直接导致骨关节炎发病的关键因素[17]。

虽然衰老软骨细胞是一种进入稳定生长停滞状态的细胞，但其依然保持代谢活性，其分泌的趋化因子、细胞因子、蛋白酶和生长因子被统称为SASP。作为骨关节炎最主要、最直接的驱动因素，持续存在的SASP分泌可以影响邻近的细胞和组织，在周围的微环境中诱导一系列生理反应，如炎症和生长阻滞等[18]，促进关节软骨ECM大分子的降解，导致骨关节炎的发生[19]。具体言之，趋化因子与细胞因子如CCL2、CCL4、白细胞介素-1(interleukin-1，IL-1)、白细胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、肿瘤坏死因子(tumor necrosisfactor，TNF)等表达的上调可引起巨噬细胞浸润，ROS产生，DNA损伤及生长停滞，出现炎症和疼痛[20]；基质金属蛋白酶(matrix metallo protease，MMP)、Ⅰ型血小板结合蛋白基序的解聚蛋白样金属蛋白酶(a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs，ADAMTS)等蛋白酶的表达会引起细胞外基质降解以及软骨损失[21]；而生长因子如转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)、人胰岛素样生长因子结合蛋白1(insulin-like growth factor-binding protein，IGFBP)等则可促进骨生长，或导致骨赘的形成[4]。

2 microRNA在骨关节炎软骨细胞衰老中的调控

microRNA是一种长约22nt的双链RNA分子，通过与靶mRNA内的特定序列结合，进而调控转录后的基因表达水平，在软骨细胞发育和软骨内稳态中起到了关键作用。研究证明，许多microRNA通过影响不同基因以及信号通路，在软骨细胞的凋亡、自噬和衰老中发挥作用。软骨细胞中任何microRNA的缺失均会导致骨骼发育缺陷，而某些特定microRNA的缺失则会导致关节软骨细胞衰老，从而提高骨关节炎的发病率[22]。因此，明确microRNA影响衰老的分子机制可为骨关节炎的诊治提供思路。本文总结了骨关节炎软骨细胞衰老相关microRNA，并讨论了其在骨关节炎软骨细胞衰老相关病理中的机制及意义。

2.1 miR-140目前，研究最多的软骨microRNA为miR-140。研究发现，转染miR-140可通过负调控磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)/丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(serine/threonine protein kinase，Akt)通路相关基因表达，抑制IL-1β诱导的骨关节炎软骨细胞中的衰老相关标志物SA-βGal、p16INK4a、p21、p53的表达[23]，减少SASP分泌，抑制IL-1β诱导的软骨细胞衰老和ECM稳态失衡[24]。此外，调节Notch通路可能是miR-140调控骨关节炎软骨细胞衰老的机制之一。Notch是单程跨膜细胞表面受体，具有动态调控SASP的作用，抑制Notch信号传导可减少细胞衰老的相关特征[25]。而Notch信号通路中的关键基因如JAG1 、ADAM10和HEY1等，被证实可作为miR-140的靶点，在细胞衰老过程中发挥重要作用[23]。

2.2 miR-34amiR-34a在由人骨关节炎软骨细胞提取的衰老细胞胞外囊泡(extracellular vesicles，EVs)中表达增多，而清除衰老软骨细胞可使EVs中miR-34a下降[26]。转染miR-34a可以通过PI3K/Akt信号通路，负调节DLL1，激发软骨细胞的死亡和衰老，增加 SA-β-gal 阳性染色的软骨细胞，上调p16基因水平及其下游相关SASP的表达，诱导骨关节炎的发生[27]。同时，miR-34a在控制氧化应激诱导的软骨细胞衰老过程中发挥调节作用。研究发现，miR-34a通过靶向沉默信息调节因子1(silence infor-mation regulator 1，sirtuin 1，SIRT 1)诱导细胞衰老，而在衰老细胞或衰老组织中上调的miR-335、miR-494和miR-34a可抑制参与抗氧化通路的基因，使衰老细胞更易受氧化应激的影响[28]。

2.3 miR-146amiR-146a在早期人骨关节炎患者的软骨中高度表达，可通过核转录因子-κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)信号通路靶向肿瘤坏死因子受体相关因子6(Tumor necrosis factor receptor-associated factor 6，TRAF6)和IRAK1，减少白细胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)诱导的MMP-13表达，影响炎症、软骨细胞自噬、凋亡、衰老以及细胞外基质基因的表达[29]。研究表明，miR-146a 还可以通过靶向Notch信号通路，抑制SASP(包括IL-1β、IL-6、TNFα和IL-8)的表达，并通过直接调节IL-1β诱导的软骨细胞的分解代谢作用来调节软骨细胞炎症[30]。

2.4 miR-199与miR-193b研究表明，miR-199a-3p与miR-193b的表达随年龄的增长而上调，并通过抑制BMP信号通路的关键下游介质Smad1的表达，降低软骨低聚基质蛋白(cartilage oligomeric matrix protein，COMP)、Ⅱ型胶原蛋白(collagen-Ⅱ，Col-Ⅱ)I和Sox9等软骨形成的早期标记基因的表达，延缓软骨细胞的衰老[31]。另有最新研究同样发现，miR-199的表达在骨关节炎的发病过程中发挥了消极作用，这是由于miR-199可以通过调控IL-1β与MMP3水平，影响相关金属蛋白酶和细胞因子的表达水平，加速软骨细胞的衰老进程[32]。

2.5 miR-495miR-495在人骨关节炎软骨中也有升高。研究表明，miR-495过表达可直接靶向AKT1/mTOR信号通路，增加衰老标志物 SA-β-gal、p16等的表达，刺激ECM降解相关的酶的产生，诱导软骨细胞衰老和凋亡。而下调体内miR-495的表达则可抑制ADAMTS-5、MMP-1、MMP-13等SASP的产生，并增加Col Ⅱ和聚集蛋白聚糖的表达[33]。

2.6 miR-204研究显示，持续氧化应激会导致软骨细胞内DNA损伤逐渐积累，增加miR-204表达水平，导致软骨细胞衰老。同时，衰老细胞或衰老组织中上调的miR-204会抑制参与抗氧化通路的基因，使衰老细胞更容易受到氧化应激的影响。另有研究证实，miR-204是控制软骨细胞中硫酸化蛋白聚糖(proteoglycan，PG)合成的关键调节剂，抑制miR-204的表达可恢复PG合成，抑制软骨细胞中炎症性SASP的表达，促进骨关节炎的恢复[34]。

2.7 miR-24miR-24是细胞周期抑制剂p16INK4a的负调节剂。Philipot等[35]研究发现，经 IL-1β 处理的关节软骨细胞中出现了miR-24和miR-24编码簇的抑制，使p16INK4a及后续的SASP(包括MMP1、MMP13)表达增加，从而将软骨细胞推向类似于终末分化软骨细胞的衰老样表型。研究提示，恢复或维持miR-24编码簇的表达水平可作为骨关节炎的一种治疗方法。

2.8 miR-101癌基因HRAS的过表达可通过MAPK信号通路减弱IL-1β诱导的骨关节炎软骨细胞凋亡、衰老和ECM降解。而新近研究发现，miR-101可对HRAS的表达起到抑制作用。但通过使用内源性竞争RNA(ceRNA)LINC00623与HRAS竞争miR-101结合，可以减弱miR-101对HRAS的抑制作用[36]。

3 microRNA与骨关节炎的中医防治

3.1 骨关节炎软骨细胞衰老的中医病机骨关节炎在祖国医学中当属“骨痹”范畴，临床表现以“关节疼痛不用，关节拘挛，步履艰难，骨节沉重，活动不利”为主，其主要病机包括肾气亏虚与气滞血瘀，而此内外两因与现代医学关于软骨细胞的衰老机制具有相似的内涵。

在中医理论中，肾为先天之本，内藏一身之精气，主司机体的生长发育，并具有“主骨生髓”的生理功能。《医精经义》中所载：“肾藏精，精生髓，髓生骨，故骨者肾之所主也；髓者，肾精所生，精足则髓足，髓足者则骨强”，说明肾中充足的精气是骨关节维持正常的生长发育及再生修复的重要保障。但随着年龄的逐渐增长，肾中精气逐渐耗竭，会出现以肾气亏虚为主要表现的各种机体功能的衰退[37]，这种功能的衰退对应了现代医学中衰老的过程。肾气虚衰，则气血生成不足，骨关节失于濡养，失去正常的再生与自我修复功能。由此可见，肾气亏虚后筋骨失于濡养而导致的软骨再生修复功能的衰退，与现代医学关于骨关节炎软骨细胞衰老的复制性衰老机制相似。

此外，无论风寒、痰湿之邪侵袭关节，或劳累过度，亦或外伤，最终都将导致关节的脉络瘀阻、气血不通。骨关节周围经络不通，气血难以濡养筋骨，筋骨不荣则痛[38]；气血运行不畅还会使关节损伤或衰老后的病理产物难以代谢，积于关节，关节不通则痛，加速软骨关节的衰老。这也在一定程度上解释了软骨细胞应激性衰老的产生机制。

3.2 中医药防治骨关节炎软骨细胞衰老的microRNA调控骨关节炎软骨衰老的基本病机为肾气亏虚及气滞血瘀，因此中医临床治疗骨关节炎以补益肝肾、逐瘀通经两种治则为主。补肝肾以固本，延缓机体、关节的自然衰老；调气血以治标，改善因外邪、外伤、劳累等各种原因导致的关节功能衰退。现有研究表明，中医药在骨关节炎的发生发展中能够在软骨细胞的衰老机制方面发挥积极的调控作用。如郑允彬等[39]使用具有补益肝肾、活血祛瘀功效的羌归膝舒丸治疗膝骨关节炎，结果发现该药可升高miR-140以及miR-146a的表达，降低SASP炎性因子IL-6、IL-1β的表达，缓解骨关节炎疼痛、僵硬，改善日常生活能力。王欢等[40]发现桂枝有效成分桂皮醛在调节miR-146a干扰的骨关节炎滑膜炎方面同样具有积极的治疗作用。有学者研究证实，补肾活血中药在膝骨关节炎的防治中具有较好的疗效，其机制可能是通过调节软骨细胞内miR-140及其下游相关靶基因的表达，减少衰老相关标志物的生成，缓解软骨关节的炎症[41]。吴广文等[42]使用独活寄生汤灌胃3个月，观察膝骨性关节炎大鼠膝关节软骨组织。结果发现，相较于模型组，独活寄生汤灌胃后的大鼠软骨组织中miR-146a表达上升，miR-155表达下降，下游相关靶基因 NF-κB p65以及p38MAPK表达显著下降，使得组织一氧化氮合酶、环氧合酶2、MMP3和MMP13检测值降低，提示独活寄生汤可通过调控miR-146a和miR-155的表达水平，影响其下游NF-κB/p38MAPK信号通路，抑制软骨细胞衰老及炎症的发生，发挥治疗作用。

除了中药治疗，针灸对于骨关节炎软骨细胞衰老同样具有较好的治疗作用。陈后煌[43]以电针进行干预，观察其对骨关节炎软骨退变的影响，结果发现电针干预可以明显改善膝骨性关节炎大鼠软骨的形态结构损伤及炎症状态，调控miR-34a、miR-146a 及miR-27b的基因表达水平，抑制细胞外信号调节激酶1/2信号通路及其下游因子的激活，促进软骨细胞Col Ⅱ的合成，延缓骨关节炎软骨退变。

4 讨论与展望

引起软骨细胞衰老的主要因素有线粒体功能障碍、机械载荷过大、复制衰老、氧化应激、DNA损伤等，上述因素会导致端粒损伤，提高p53、p21、p16等基因的表达及ROS的生成，继而引起SASP分泌的增加，导致软骨细胞ECM降解的增多，此亦为软骨细胞衰老发病的主要机制。目前，基于microRNA的调控软骨细胞衰老的相关研究主要围绕p53、p21、p16INK4a、SIRT1、Smad1、COLII、Sox9等基因及PI3K/AKT、Notch、NF-κB、AKT1/mTOR等信号通路展开，多通过调节软骨细胞SASP分泌及ECM稳态对软骨细胞的衰老发挥作用。目前，研究重点为明确microRNA在软骨细胞衰老中的不同调控作用，根据其具体功能恢复、维持或抑制、下调其表达，从软骨细胞衰老的角度入手为骨关节炎的诊治提供思路。

中医认为，骨关节炎的病机包括肾气亏虚之内因、气滞血瘀之外因两方面，这与现代医学的复制衰老及损伤应激机制具有相似内涵。虽然目前中医药干预骨关节炎的研究日渐增多，补益肾气、活血化瘀类中药及针灸调控microRNA及软骨细胞衰老的作用机制也已被证实，但相关研究仍有待深入、系统地开展，推拿、针灸等中医外治法研究也需进一步加强。

在世界范围内，骨关节炎的发病率仍在逐年上升。软骨细胞衰老作为骨关节炎的重要发病机制，已经成为当前临床及科研的研究热点。microRNA作为一种新的基因表达调控分子，在调控软骨细胞衰老方面发挥着重要作用，深入了解microRNA的调控机制对于骨关节炎的防治至关重要，但目前对其分子机制尚未完全阐明，microRNA和软骨细胞衰老之间的具体关系亦有待明确，且中医药干预的研究方法、研究手段存在局限性。

今后，中医药调控microRNA相关研究可围绕骨关节炎的内外病机展开，从分子生物学角度研究中医补益肾气、行气活血的现代科学机制，阐释中医药防治骨关节炎的潜在机制，为临床治疗提供新的思路。