生理性和病理性心肌肥厚组织中心钠素表达的差异研究

2022-11-14李正宽包雅丽麦丽克扎提阿不都热西提

中国临床新医学 2022年7期

李正宽，孙湛，包雅丽，麦丽克扎提·阿不都热西提

1981年，de Bold 等首次发现心钠素(atrial natriuretic peptide,ANP)。此后，随着研究的深入，学者们发现ANP在体内表达增高时，可发挥拮抗病理性心肌肥厚和心室重构的作用，从而起到保护心脏结构和功能的作用。研究表明，病理性心肌肥厚是心血管疾病的独立危险因素。在长久、持续的病理性刺激下，心肌肥厚常常伴有心肌纤维化、收缩功能失调和能量代谢异常等，最终导致失代偿性的心力衰竭。而生理性心肌肥厚通常出现在长期的运动刺激中，是一种可逆的、健康的心肌肥厚。适当的运动训练可使心肌细胞增大、增殖，抵抗凋亡作用，从而保护心脏功能。本研究通过建立生理性和病理性心肌肥厚的大鼠模型，分析ANP在两种心肌肥厚组织中表达的差异，为病理性心肌肥厚的诊断、预防和治疗提供理论基础。现报道如下。

1 材料与方法

实验动物与分组无特定病原体(specific pathogen-free，SPF)级8周龄雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠15只，购于新疆医科大学动物实验中心，平均体重180.00 g。将其随机分为对照组(CON组)、异丙肾上腺素组(ISO组)和运动组(EXE组)，每组5只。本研究经新疆医科大学实验动物伦理委员会批准(伦理审批号：IACUC-20210702-06)。

主要试剂与仪器兔抗大鼠ANP抗体(中国ABclonal公司)，山羊抗兔IgG/辣根酶标记(中杉金桥公司)，石蜡切片机(德国Leica公司)，BCA蛋白定量分析试剂盒(Thermo Fisher Scientificals公司)，光学显微镜(日本Nikon公司)，盐酸异丙肾上腺素注射液(上海禾丰制药有限公司)，一步法10% SDS-PAGE凝胶快速制备试剂盒(中国Biotides公司)，冷冻组织样品研磨机(上海净信公司)，增强型二氨基联苯胺(diaminobenzidine,DAB)显色试剂盒(中国Proteintech公司)。

模型建立 (1)病理性心肌肥厚：颈部多点皮下注射异丙肾上腺素，第1～3次注射1.25 mg/(kg·d)，间隔48 h；第4～21次注射2.5 mg/(kg·d)，间隔24 h。(2)生理性心肌肥厚：采用有氧运动(游泳)诱导。第1周，每天无负重游泳1次，每次间隔24 h，连续6 d，第1天游泳20 min，此后每天递增20 min至每天游泳训练60 min。第2～6周，每次无负重游泳60 min，2次/d，每次间隔6 h，每周连续6 d。第7～8周，2次/d，第1次无负重游泳60 min，第2次负重游泳60 min，每次间隔6 h，每周连续6 d。(3)对照组不予特殊干预。在第8周末采用过量麻醉法处死大鼠，肌肉注射舒泰+盐酸赛拉嗪(1∶1)0.2～0.4 ml/kg，取出心脏，分装入4%多聚甲醛和液氮中保存。

HE染色在4%多聚甲醛溶液中取出心肌组织，进行心肌脱水、透明、浸蜡和包埋后，横切成4～5 μm的切片，常规HE染色。在显微镜下观察、拍照。

免疫组化染色制备石蜡切片，将切片置入60 ℃烤箱中烤片60 min，脱蜡、水化后浸入EDTA抗原修复液，微波加热修复抗原，冷却后用磷酸盐缓冲液(phosphate buffered solution，PBS)冲洗5 min×3次，牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)封闭30 min。倾倒去封闭液，滴加ANP一抗，湿盒孵育过夜。次日复温后用PBS冲洗5 min×3次，擦干滴加辣根酶标记的二抗，湿盒室温孵育30 min。PBS冲洗5 min×3次，滴加DAB显色液。镜下观察孵育，自来水冲洗，苏木素复染40 s，自来水冲洗，盐酸酒精分化3 s，蒸馏水冲洗，中性树胶封片后在显微镜下观察。使用Image J软件进行积分光密度计算。

Western-blot法检测心肌组织中ANP的表达将心肌组织中加入裂解液，进行低温研磨，冰上裂解30 min，4 ℃离心后吸取上清液，蛋白定量，100 ℃水浴变性10 min。样品经10% SDS-PAGE电泳分离，使用PVDF膜转膜，5%脱脂奶粉封闭2 h，4 ℃慢摇床孵育ANP一抗过夜。次日以TBST洗膜10 min×3次，避光慢摇床孵育二抗90 min，TBST洗膜10 min×3次。化学发光ECL显影系统成像。

统计学方法应用SPSS13.0和GraphPad Prism 9统计软件进行数据分析。采用单因素方差分析(One-way ANOVA)进行三组间的计量资料比较，以LSD-

检验进行组间两两比较。

<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

HE染色结果与CON组相比，EXE组和ISO组的心肌纤维明显增粗，且ISO组还出现了心肌纤维间隙增宽、排列紊乱等结构受损的特征，而EXE组的心肌纤维则排列整齐，结构完整。见图1。

图1 三组心肌组织镜下观察所见(HE染色，×400)

免疫组化染色结果 ANP主要表达于心肌细胞的胞浆中，表达为棕褐色。ISO组的ANP积分光密度高于CON组和EXE组，差异有统计学意义(

<0.05)。EXE组的ANP积分光密度略高于CON组，但差异无统计学意义(

>0.05)。见图2。

=19.070，=0.000；*表示<0.05，ns表示>0.05

图2 三组免疫组化染色结果(×400)及ANP积分光密度比较图

Western-blot检测结果 ISO组ANP蛋白表达水平高于EXE组和CON组，差异有统计学意义(

<0.05)。EXE组ANP蛋白表达水平高于CON组，差异有统计学意义(

<0.05)。见图3。

=386.400，=0.000；*表示<0.05

图3 三组Western-blot检测结果及ANP蛋白表达水平比较图

3 讨论

心肌肥厚是心脏对于长期血流负荷增加时的适应性改变。其中，病理性心肌肥厚是冠状动脉疾病和心力衰竭发展的重要预测指标，在长期的慢性病理性刺激下，心脏从适应性肥大转变为不可逆转的病理性心肌肥大，进而导致心功能下降、心室重塑甚至心力衰竭。本研究发现，对于运动诱导的生理性的心肌肥厚，其心脏结构异于病理性心肌肥厚，功能未发生病理性改变。有研究表明，运动可使心血管疾病的发病风险降低50%，并显著降低心力衰竭患者的病死率和反复住院率，且运动诱导的生理性心肌肥厚具有可复性。因此，尽快检测并区分生理性心肌肥大和病理性心肌肥大，对于预防病理性心肌肥厚的发生具有重要的临床意义。

ANP通常由心房肌细胞合成和分泌，在胚胎心脏中ANP含量较高，出生后下降，在成年人正常心脏中几乎不表达。然而，当病理性心肌肥厚、心力衰竭或心肌梗死发生时，心室可大量生成和分泌ANP。研究表明，对于运动年限较长的人群，其安静状态下的血浆ANP水平更低。在本研究中，笔者分别通过皮下注射异丙肾上腺素增加心脏负荷和游泳运动来构造了大鼠的病理性和生理性心肌肥厚模型。HE染色结果显示，相较于CON组，ISO组心肌纤维明显增粗，且出现结构破坏、排列紊乱；EXE组也同样出现了心肌纤维增粗的情况，但结构未出现破坏且排列整齐。结果提示SD大鼠的生理性和病理性心肌肥厚模型构建成功。Western-blot检测和免疫组化染色结果发现，ANP主要表达于心肌细胞的胞浆中，在病理性心肌肥厚中，ANP的表达量显著提升；而在生理性心肌肥厚组织中，ANP表达水平略高于CON组，但明显低于病理性心肌肥厚组织。笔者认为长期的有氧运动也使ANP在生理性心肌肥厚组织中有着较高表达。也有研究表明，对于施行适量有氧运动的干预组，其ANP的表达量高于对照组，而力竭运动却会导致ANP表达量低于对照组。

在临床诊疗中通常认为ANP和脑钠肽(brain natriuretic peptide,BNP)的水平增高程度与心衰严重程度呈正比，可作为评价心力衰竭及判断其预后的指标。然而本研究发现，当予以长期的有氧运动时，ANP也会表达于生理性心肌肥厚组织。笔者还发现，生理性心肌肥厚组织ANP的表达量低于病理性心肌肥厚组织。目前，临床医师对于心脏运动的认识虽有提升，但仍然主要局限于使用心电图进行鉴别，而由于机体的差异性以及生理性心肌肥厚的可复性，故仍存在大量的漏诊和误诊情况。因此，在未来的临床诊疗中，可以考虑通过结合ANP来更详细地区分不同类型的心肌肥厚，提高诊断的正确率。

有研究表明，ANP对于血流动力学和心脏结构都有着重要的作用，ANP的适当升高可以使心排血量降低，从而改善左心舒张功能。也有学者研究表明，ANP在诱导脂肪分解、脂质的氧化和动员及改善胰岛功能敏感性上也有着明显的作用。结合本实验结果，笔者认为适当的有氧运动可以通过提升ANP水平从而改善心功能，降低罹患心血管疾病的风险。一些研究者已经通过体内外试验发现，一定剂量水平的ANP具有治疗心血管疾病和代谢疾病的作用。马赟聪和王玉哲的研究表明，使用中药材橙皮素可以使经胸主动脉结扎诱导的病理性心肌肥厚小鼠模型的ANP表达水平降低，从而缓解病理性心肌肥厚，改善心室重塑和心功能。因此，适量ANP辅助治疗在预防和治疗心血管疾病中可能具有一定的应用前景。然而，ANP水平升高和降低的分子机制，及其改善已经发生心功能降低患者的心功能状态以及预防病理性心肌肥厚的机制尚不明确，尚需要更为深入的研究。

综上所述，ANP在生理性心肌肥厚组织中略有提升，在病理性心肌肥厚组织中升高显著，可作为诊断病理性心肌肥厚的辅助诊断指标。