慢性应激在血管内膜增生中的作用及分子机制的研究进展

王 铮(综述)，李 香(审校)

血管内膜增生是一种以血管内膜过度增厚和管腔狭窄为主要特征的血管病变，其形成涉及内皮细胞功能紊乱、免疫炎症反应和血管中膜平滑肌细胞增殖等过程。血管内膜增生也是动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)、血管成形术、冠状动脉旁路移植术后再狭窄等心血管疾病共同的病理生理特征，与血管重塑关系密切。防止内膜增生及术后再狭窄一直是国内外研究的重要课题。慢性应激是指机体内外长期受到各种负面因素的刺激而产生的非特异性全身反应。在消极的生活事件中，慢性应激普遍存在，并与血管内膜增生密切相关。研究发现，慢性应激情况下，血管内膜增生是增强的。组织蛋白酶(cathepsin)是溶酶体蛋白酶家族的重要成员。目前已发现19种组织蛋白酶，可分为丝氨酸、天门冬氨酸和半胱氨酸组织蛋白酶三大类，cathepsin S(CatS)、cathepsin K(CatK)属于半胱氨酸组织蛋白酶。以往研究表明，CatS、CatK两种亚型可促进血管内膜增生病变的进展，慢性应激可使损伤血管增生内膜的CatS、CatK基因及蛋白表达增加，增加其在血管内膜病变中含量，增强其对下游信号通路激活作用，进而促进血管内膜增生。本文将慢性应激与CatS、CatK促进血管内膜增生的信号通路联系进行阐述，以期人们更了解慢性应激对血管内膜增生的重要作用，进而从高危因素的源头预防疾病的发生。

1 慢性应激在血管内膜增生中的作用

在传统的危险因素中，例如高脂血症，40%的AS危险因素与慢性应激有关。慢性应激引起血管内膜增生的作用分为以下几方面：(1)慢性应激可引起血流动力学改变，导致局部内皮损伤。受损的血管内皮细胞可使受损的血管内膜暴露于多种致病因素下，激活内源性和外源性凝血途径，进而导致血栓形成，而局部血栓形成可逐渐导致早期管腔狭窄或闭塞。(2)慢性应激造成血管内膜损伤后，局部受损的血管可产生多种细胞因子、趋化因子和炎症介质，如血小板源性生长因子、胰岛素样生长因子等。在这些因素的刺激下，平滑肌细胞大量增殖，导致新生内膜增生，加重血管狭窄的病理转归。(3)长期的应激还可导致一氧化氮和内皮素之间的失衡，并导致内皮功能障碍，最终促进血管内膜增生。(4)慢性炎性应激可导致组织蛋白酶表达的增加，调节血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)在心血管炎症和代谢紊乱中的细胞迁移、侵袭，这无疑加速了血管内膜增生的进程。在基础研究方面，Meng等在应激小鼠模型实验中，发现应激病变与非应激病变相比，基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)-2和MMP-9基因水平及凝胶溶解活性明显升高，在血管重塑过程中，应激增强了细胞外基质蛋白的水解，最终导致血管内膜增生。而新生血管形成的过程与各种蛋白水解系统的细胞外基质重塑有关。大量研究支持MMP参与这一过程。Meng等通过建立新西兰兔应激模型研究发现，与单纯的高脂饮食组相比，高脂饮食增加慢性应激后，内膜及中膜厚度的增加更为显著。该研究证实，慢性应激与其他危险因素[例如低密度脂蛋白胆固醇(low-density lipoprotein cholesterol,LDL-C)或总胆固醇(total cholesterol,TC)]相比更能促进血管内膜和中膜增生。它是内膜和中膜增生的重要的独立危险因素之一。这为预防应激相关的血管内膜增生的发生发展提供了理论依据。

2 慢性应激参与血管内膜增生的分子机制

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慢性应激可通过CatS相关的信号通路促进血管内膜增生 组织蛋白酶家族是半胱氨酸组织蛋白酶的一种，其在人体各种细胞溶酶体中起“清道夫”作用。目前，人体组织及细胞内共发现19种组织蛋白酶，其中CatS具有较强的胶原蛋白和弹性蛋白分解活性，其表达水平可预测AS心血管疾病的发生、发展及预后。研究发现，CatS存在于人AS病变中，而正常血管中CatS表达很少。早期AS斑块中，CatS主要表达于内膜和中膜的平滑肌细胞，而在进展的粥样斑块中，CatS主要定位于纤维帽的巨噬细胞和平滑肌细胞中。动物实验结果也表明，损伤后增生的新生内膜中CatS表达增高，并参与血管重构。过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPAR-γ)是可连接转录因子核超家族的成员，PPAR-γ通过与类视黄醇X受体结合作为专属性异二聚体的PPAR反应调节元件，控制参与脂肪生成、血管生成和维持代谢稳态的基因网络的表达，PPAR-γ活化与多种细胞生物学事件的调节有关，包括细胞分化、迁移和增殖。2015年Li等报道了CatS介导的PPAR-γ活化以及PI3K/Akt-血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)信号转导通路调节血管内皮细胞及其祖细胞增殖行为，促进血管再生的新机制。研究结果提示，CatS可能成为慢性应激导致的经皮冠状动脉介入治疗(percutaneous transluminal coronary intervention,PCI)术后血管增生性再狭窄的新靶点。周毅则通过实验证明PPAR-γ活化后能够通过上调VSMC中解偶联蛋白2的表达，减轻了细胞的氧化应激，进而减轻因VSMC增殖、迁移引起的血管内膜增生。Wang等建立小鼠颈动脉结扎损伤模型，通过测量颈动脉横切面的新生内膜面积和新生内膜/中膜面积的比值来评估慢性应激对损伤相关的新生内膜形成的影响。结果表明，与非应激对照组相比，慢性应激可显著增加CatS小鼠血管新生内膜的面积及病变中新生内膜/中膜面积的比值。但其损伤的CatS小鼠与CatS小鼠相比颈动脉内膜病变明显减少。其分子机制可能是在慢性应激条件下，小鼠损伤颈动脉的CatS基因和蛋白表达均增加，进而通过Toll样受体-2/Toll样受体-4(Toll-like receptor-2/Toll-like receptor-4，TLR-2/TLR-4)信号通路调节炎症、免疫活动和平滑肌细胞增殖来促进血管内膜增生。Wu等研究发现，与CatS小鼠相比，CatS小鼠形成了明显的内膜病变和长病变损伤，内膜/中膜面积比值也较高。定量检测结果显示CatS小鼠的内膜增生面积明显低于CatS小鼠，增殖细胞核抗原染色显示，CatS小鼠损伤的颈动脉内膜和中膜的增殖活性均低于CatS小鼠。最终得出结论：(1)在分子水平上，CatS的缺失延缓了损伤诱导的TLR-2基因及其下游炎症基因以及p38MAPK、Akt和HDAC6信号的激活；(2)TLR-2沉默减轻了HDAC6、p38MAPK、Akt和VSMC功能的磷酸化，减轻了VSMC的增殖和迁移。由此可知，CatS可能通过TLR-2介导的p38MAPK/Akt信号通路激活和HDAC6介导的VSMC迁移和增殖控制损伤相关的血管修复。这与Muto等的研究结果一致，即p38MAPK、Akt和有丝分裂活化蛋白激酶1/2(mitogen-activated protein kinase 1/2,ERK1/2)信号通路在VSMC增殖、迁移和新生内膜形成过程中起重要作用。Yu等建立了兔的慢性应激模型，实验结果显示，手术+高脂饮食+慢性应激组与对照组、高脂饮食组、手术+高脂饮食组相比，血管生成素(angiogenin,Ang)蛋白增加了348.6倍。促血管生成基因Ang和VEGF-A的表达各增加了2.2倍。VEGF家族是最常见的促进血管生成的因子，VEGF-A作为重要的成员，可通过促进单核细胞活化、黏附和迁移，增加内皮细胞通透性，促进内膜增生。由此可见，慢性应激作为一种实验条件，在增加此因素后，促血管生成的因素明显增加，最终导致新生血管的增加。

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慢性应激可通过CatK相关的信号通路促进血管内膜增生 CatK属于半胱氨酸组织蛋白酶的成员，CatS、CatK是发现在人类AS病变中表达的组织蛋白酶。以往研究表明，与非应激对照斑块相比，应激AS斑块含有高水平的CatK。除AS斑块外，在球囊损伤性再狭窄模型中，也发现了动脉内膜病变中CatK的表达增加。慢性应激可加速炎症和小鼠的血管内膜增生，在损伤后内膜增生的过程中，CatK参与应激诱导的血管重塑。Meng等通过建立小鼠结扎诱导颈动脉损伤模型以及增加慢性应激条件，观察到慢性应激可增强CatK基因、CatK蛋白表达，慢性应激CatK小鼠中的受损颈动脉中p-p38、p-mTOR和p-Akt蛋白的水平以及CatK和AT1R蛋白的水平高于对照组小鼠，有助于结扎损伤后应激相关的血管重塑。CatK抑制剂降低了应激小鼠受损颈动脉中AT1R、p-p38、p-mTOR和p-Akt蛋白水平，减轻了应激小鼠损伤颈动脉中新内膜的形成和新内膜与中膜的比率。综上表明，CatK可通过AT1R-Akt/mTOR和p38信号依赖的VSMC增殖，进而促进血管内膜增生。表明CatK有望成为血管内介入治疗后慢性应激相关再狭窄的新治疗靶点。Hu等建立小鼠结扎诱导颈动脉损伤模型的实验结果显示，CatK与CatK小鼠相比，动脉病变中TLRs(TLR-2/TLR-4)表达明显减少。CatK的缺乏也降低了动脉病变中p-PI3K、p-Akt、p-p38MAPK和p-mTOR蛋白的水平。在分子水平上，CatK缺乏延缓损伤诱导的TLR-2/TLR-4及其下游炎症基因和PI3K/Akt介导的p38MAPK和p-mTOR信号通路激活。利用CatK抑制剂后产生的抗增殖作用可能与TLR-2/TLR-4介导的PI3K/Akt-mTOR和PI3K/Akt-p38MAPK信号通路激活减少有关。综上所述，CatK通过TLR-2/TLR-4介导的PI3K/Akt-p38MAPK和PI3K/Akt-mTOR信号通路可能是应激损伤诱导的血管重塑和新内膜形成的共同机制。内皮Notch1受体已被证明对血管生成至关重要。Jiang等建立了缺氧应激模型，在培养的内皮细胞中，缺氧应激增强了VEGF诱导的CatK表达和活性，基因或药物干预对CatK的抑制损害了成熟内皮细胞和内皮祖细胞的促血管生成活性，并伴随着与VEGF蛋白表达以及Akt磷酸化降低相关的c-Notch1的产生减少。综上可知，慢性应激可通过激活CatS、CatK相关多种信号通路引起血管内膜增生。这些信号通路的级联起点是CatS、CatK，由此假设是否可以通过应用以上两种蛋白酶的抑制剂减轻病理性血管内膜增生，CatS、CatK是否可以成为防止血管内膜增生治疗新靶点，有待更多的研究证实。

3 结语

大量研究均证实了慢性应激及CatS、CatK相关信号通路在血管内膜增生的关键作用。然而，目前对于慢性应激及其相关信号通路影响血管内膜增生的研究还不够详尽，还缺乏有关的临床研究及证据去证实是否可以将CatS、CatK作为治疗靶点减轻血管内膜增生。随着科技不断进步，CatS、CatK相关信号通路有望成为新的治疗靶点来减少血管内膜增生性疾病的发生。