癌-睾丸抗原NY-SAR-35在结直肠癌组织中的表达情况及其临床意义

王燕靖，沈 宁，罗 彬，赵英伦，陆绍龙，叶小龙，张 沅，张煜萱，谢小薰，张庆梅

结直肠癌(colorectal cancer，CRC)是常见的恶性肿瘤，位居肿瘤死亡的第四位。CRC患者早期症状隐匿，大部分患者首诊时已属晚期。虽然近年手术切除辅以放化疗等传统治疗方式取得了较大进展，但晚期CRC患者的预后情况并未得到显著改善。新的辅助治疗策略仍是现在研究的热点，免疫治疗则是其中一种具有临床应用前景的新型治疗方法，但开展肿瘤免疫治疗需要鉴定肿瘤特异性抗原。癌-睾丸抗原(cancer-testis antigen,CTA)在多种肿瘤中高表达，而在除睾丸和胎盘之外的正常组织限制性表达，被认为是肿瘤免疫治疗的理想靶抗原。NY-SAR-35是CTA家族中的一员。有文献报道NY-SAR-35 mRNA在CRC组织不表达，但该研究仅检测了9例CRC组织，且缺少癌旁组织及临床意义分析，其结果难以客观地反映NY-SAR-35在CRC的表达情况。鉴此，本研究扩大CRC样本例数，并收集匹配的癌旁组织及患者临床资料，应用逆转录聚合酶链反应(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)技术检测NY-SAR-35 mRNA的表达，并分析其临床意义，以初步评估其在预测CRC患者预后和作为免疫治疗靶抗原的应用前景。

1 对象与方法

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研究对象 选择2009年10月至2012年5月于广西医科大学第一附属医院普外科接受手术治疗的CRC患者59例。其中男42例，女17例；年龄30～86(55.55±14.36)岁；根据美国癌症联合委员会(American Joint Committee on Cancer,AJCC)的TNM分期标准，Ⅰ～Ⅱ期38例，Ⅲ～Ⅳ期21例。均经手术取癌组织及配对的癌旁组织。研究获广西医科大学伦理委员会批准(批号：审20210157号)，标本获取前均经患者及其家属同意。

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纳入与排除标准 纳入标准：(1)经组织病理学检查确诊为CRC；(2)临床资料完整。排除标准:(1)入院前已接受其他抗肿瘤方案治疗；(2)合并其他严重自身免疫性疾病；(3)伴发其他恶性肿瘤。

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资料收集 通过医院电子病历系统收集患者的临床资料，包括性别、年龄等一般人口学信息，以及肿瘤大小、临床分期、组织学类型、转移情况等疾病情况信息。

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标本采集 腹腔镜手术中切取CRC患者肿瘤组织和癌旁组织(距离肿瘤边缘>1.5 cm)各59例，其中结肠部位25例，直肠部位34例。CRC组织标本均经2名以上有经验的主任病理医师检查确诊。组织离体后15 min内，置液氮速冻，后转置-80 ℃低温冰箱保存备检。

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NY-SAR-35 mRNA检测方法

1.5.1 总RNA提取 取约300 mg组织标本，迅速加入裂解液后进行匀浆，应用RNA抽提试剂盒(诺唯赞生物科技股份有限公司)提取组织总RNA，操作严格按照说明书进行。所得总RNA溶于无RNA酶的纯水中，用微量分光光度计检测其浓度和纯度，并经琼脂糖凝胶电泳确认无降解。

1.5.2 cDNA合成 取1 μg总RNA，按照逆转录试剂盒(HiScript Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis Kit，诺唯赞生物科技股份有限公司)说明书将总RNA逆转录为cDNA。经PCR扩增管家基因P53检测cDNA的质量，将合格的cDNA用于目的基因扩增。P53引物序列：5′-CGTGAGCGCTTCGAGATGTTCCG-3′(上游)，5′-CCTAACCAGCTGCCCAACTGTAG-3′(下游)，由上海吉玛公司合成。

1.5.3 目的基因扩增 应用2×Rapid Taq Master Mix试剂盒(诺唯赞生物科技股份有限公司)进行RT-PCR。反应体系：PCR Master Mix(2×Premix)12.5 μl，ddHO 9.5 μl，上、下游引物各1.0 μl，cDNA 1 μl。反应条件：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35个循环，最后72 ℃充分延伸10 min。NY-SAR-35引物序列：5′-CTTGGTGCGATCAGCCTTAT-3′(上游)，5′-TTGATGCATGAAAACAGAACTC-3′(下游)。以睾丸cDNA作为阳性对照，以DEPC处理水代替cDNA模板作为阴性对照。RT-PCR反应完毕取产物10 μl行1.5%琼脂糖凝胶电泳，通过凝胶成像系统观察结果。以P53为内参，保证各标本内参条带亮度一致的前提下，目的基因扩增条带清晰可见即为阳性表达。将已纯化PCR产物送北京诺赛基因组研究中心有限公司进行DNA测序。

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随访 通过医院电子病历系统记录和电话随访方式收集患者随访资料。在术后2年内，每3个月随访1次；术后3～4年每6个月随访1次；手术5年后每年随访1次。本次研究随访时间截至2020年5月，以发生死亡为结局。

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统计学方法 应用SPSS20.0统计软件进行数据分析。计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用成组

t

检验。计数资料以例数(百分率)[

n

(%)]表示，CRC组与癌旁组织组间比较采用McNemar′s检验，NY-SAR-35阳性表达组与阴性表达组间比较采用

χ

检验。采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线，以log-rank检验进行两组间比较。采用Cox回归分析影响CRC患者生存预后的因素。

P

<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

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NY-SAR-35 mRNA电泳和测序结果 经电泳后，在300～400 bp之间出现一条清晰的条带，与NY-SAR-35 mRNA扩增产物大小(376 bp)一致。见图1。将扩增产物测序结果与美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)基因库检索序列进行BLAST比对，证实所扩增的产物为NY-SAR-35目的片段。见图2。

M：DNA marker；T1～T7：CRC组织；N1～N7：癌旁组织；P：阳性对照；Ne：阴性对照

图1 NY-SAR-35 mRNA扩增产物电泳结果图

图2 扩增产物BLAST比对结果图

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CRC组织和癌旁组织NY-SAR-35 mRNA表达情况比较 CRC组织中NY-SAR-35 mRNA阳性表达21例(35.59%)，癌旁组织阳性表达8例(13.56%)，两组比较差异有统计学意义(

P

<0.05)。见表1。

表1 CRC组织和癌旁组织NY-SAR-35 mRNA表达情况比较()

CRC组织癌旁组织阳性阴性总数阳性12021阴性73138总数85159

注：经McNemar′s检验，=0.019

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NY-SAR-35 mRNA阳性组与阴性组临床特征比较 NY-SAR-35 mRNA阳性组肿瘤直径≥5 cm的人数比例大于阴性组，差异有统计学意义(

P

<0.05)。两组在性别、年龄、肿瘤位置、癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)水平、T分期、N分期、M分期、TNM分期、组织学类型和分化程度方面比较差异无统计学意义(

P

>0.05)。见表2。

表2 NY-SAR-35 mRNA阳性组与阴性组临床特征比较[(%)]

组 别例数性别年龄(岁)肿瘤直径(cm)肿瘤位置CEA(ng/ml)T分期男女<56≥56<5≥5结肠直肠≤5>5T1～2T3～4阳性组2116(76.19)5(23.81)12(57.14)9(42.86)6(28.57)15(71.43)12(57.14)9(42.86)8(38.10)13(61.90)3(14.29)18(85.71)阴性组3826(68.42)12(31.58)20(52.63)18(47.37)24(63.16)14(36.84)13(34.21)25(65.79)22(57.89)16(42.11)11(28.95)27(71.05)χ2-0.3980.1116.4742.9132.1221.606P-0.5280.7390.0110.0880.1450.205组 别例数N分期M分期TNM分期组织学类型分化程度N0N1～3M0M1Ⅰ～ⅡⅢ～Ⅳ管状及乳头状腺癌黏液腺癌及印戒细胞癌高分化中分化低分化阳性组2117(80.95)4(19.05)18(85.71)3(14.29)15(71.43)6(28.57)21(100.00)0(0.00) 7(33.33)10(47.62)4(19.05)阴性组3826(68.42)12(31.58)35(92.11)3(7.89) 23(60.53)15(39.47)32(84.21) 6(15.79)9(23.68)18(47.37)11(28.95)χ2-1.0750.6050.7013.6910.986P-0.3000.4370.4020.0550.611

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NY-SAR-35 mRNA表达情况与CRC患者生存预后的关联性分析结果 研究对象获得随访1～98个月，随访过程中无失访患者，中位随访时间为54个月。截至随访终点，死亡36例，生存23例。CRC患者中NY-SAR-35 mRNA阴性组的生存预后优于阳性组(生存期：57.24个月 vs 40.71个月；log-rank检验：

χ

=4.356，

P

=0.037)。见图3ⓐ。进一步分层分析结果显示，无论对于TNM分期分为Ⅰ～Ⅱ期或Ⅲ～Ⅳ期的CRC患者，NY-SAR-35 mRNA阴性组的生存预后均优于阳性组(Ⅰ～Ⅱ期CRC患者生存期：77.32个月 vs 53.80个月；log-rank检验：

χ

=8.830，

P

=0.003。Ⅲ～Ⅳ期CRC患者生存期：28.60个月 vs 8.00个月；log-rank检验：

χ

=8.013，

P

=0.005)。见图3ⓑⓒ。

ⓐNY-SAR-35 mRNA阴性组 vs 阳性组；ⓑⅠ～Ⅱ期分层下NY-SAR-35 mRNA阴性组 vs 阳性组；ⓒⅢ～Ⅳ期分层下NY-SAR-35 mRNA阴性组 vs 阳性组

图3 CRC患者的生存曲线图

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影响CRC患者生存预后的危险因素分析结果以至随访结束之日发生死亡为结局进行Cox回归分析，结果显示，T分期为T期、N分期为N期、M分期为M期以及NY-SAR-35 mRNA阳性表达是影响CRC患者生存预后的独立危险因素(

P

<0.05)。见表3。

表3 影响CRC患者生存预后的Cox回归分析结果

变 量HR(95%CI)PaHR(95%CI)aP性别(男)1.046(0.504～2.171)0.903--年龄(≥56岁)1.041(0.541～2.005)0.902--肿瘤位置(直肠)1.402(0.717～2.743)0.316--肿瘤大小(≥5 cm)1.442(0.743～2.801)0.272--CEA(>5 ng/ ml)1.863(0.964～3.603)0.058--T分期(T3～4)3.312(1.167～9.399)0.01615.664(3.579～68.550)0.000N分期(N1～3)4.059(2.016～8.170)0.00040.102(11.075～145.203)0.000M分期(M1)9.785(7.238～122.563)0.000187.338(31.321～1121.000)0.000TNM分期(Ⅲ～Ⅳ)7.009(3.501～14.032)0.0002.492(0.125～49.579)0.710组织学类型(黏液腺癌、印戒细胞癌)1.252(0.443～3.543)0.668--分化程度(中分化)1.102(0.374～3.252)0.860分化程度(低分化)1.066(0.280～4.061)0.925--NY-SAR-35 mR-NA表达(阳性)1.972(1.023～3.803)0.0302.813(1.300～6.086)0.009

3 讨论

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近年来，肿瘤免疫治疗已成为继手术、放疗和化疗之后的第4种肿瘤治疗方式，其优势在于可特异性靶向肿瘤，对正常细胞伤害小。开展肿瘤免疫治疗的先决条件是鉴定肿瘤特异性抗原。CTA是一类在除睾丸和胎盘之外的正常组织中不表达，而在多种肿瘤中广泛表达，且可引发机体免疫反应的肿瘤抗原。因其独特的表达模式，CTA被认为是理想的肿瘤标志物和免疫治疗靶点。目前已有一些CTA(如MAGE-A3、NY-ES0-1等)进入临床试验阶段，在一些肿瘤的治疗中初步显示出不错的疗效。然而，现有研究显示，多数CTA在CRC中的表达率并不高，这极大地限制了CTA在CRC免疫治疗中的应用。

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NY-SAR-35是2003年由Lee等通过血清学表达克隆分析(serological analysis of recombinant cDNA expression library,SEREX)在纤维肉瘤及恶性纤维组织细胞瘤患者中鉴定出的一种CTA基因，根据其在CTA数据库的编号又称为CT37。与CTA家族的许多成员一样，NY-SAR-35基因定位于X染色体。有研究报道，NY-SAR-35 mRNA在除睾丸之外的多种正常组织几乎不表达，但在多种肿瘤中表达并具有不同的表达率：肺癌为33%，黑色素瘤为6.3%，卵巢癌为8.3%，乳腺癌为23.1%，膀胱癌为41.7%。研究发现NY-SAR-35 mRNA在肿瘤的表达可能与其基因启动子区的低甲基化有关。另外，实验研究还显示，NY-SAR-35还可增强肺癌细胞和肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力。提示NY-SAR-35可能在肿瘤的发生、发展中发挥重要作用，具有成为肿瘤标志物和免疫治疗靶点的潜力。

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本研究结果显示，CRC组织NY-SAR-35 mRNA的阳性表达率为35.59%，显著高于癌旁组织(13.56%)，这与Lee等的研究结果差异较大，考虑与研究纳入样本的例数差异及肿瘤的异质性表达有关。本研究中有2例NY-SAR-35 mRNA 阳性表达的CRC组织，其癌旁组织也阳性表达NY-SAR-35 mRNA，这可能与癌旁组织的癌前病变或肿瘤细胞浸润癌旁组织有关。癌旁组织并非真正意义上的正常组织，曾有研究者检测距离CRC组织20 mm、21～50 mm和50 mm以上的范围内收集的癌旁组织，发现离CRC组织距离越远的癌旁组织，其癌相关基因MAGE mRNA的阳性表达率越低。由此可见，在收集癌旁组织时需特别注意距离癌组织的位置和范围。此外，本研究有7例NY-SAR-35 mRNA阴性表达的CRC组织，其癌旁组织却为NY-SAR-35 mRNA阳性表达，这可能与CTA的异质性表达或肿瘤抗原调变有关。

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本研究结果显示，NY-SAR-35 mRNA表达与肿瘤直径具有显著关联性，与体积小的肿瘤组织相比，体积大的肿瘤组织NY-SAR-35 mRNA阳性表达率更高。肿瘤大小在一定程度上可反映肿瘤细胞的增殖程度，这提示NY-SAR-35可能与肿瘤的恶性生长有关。另外，生存分析结果显示，CRC患者中NY-SAR-35 mRNA阴性组的生存预后优于阳性组，且Cox回归分析结果显示，NY-SAR-35 mRNA阳性表达是影响CRC患者生存预后的独立危险因素。这些结果再次证明NY-SAR-35在CRC的致病机制中可能发挥的重要作用，且具有作为预测CRC患者预后标志物的潜在价值。

综上所述，NY-SAR-35 mRNA在CRC组织中高表达，其与肿瘤大小及患者的生存预后具有关联性，具有作为免疫治疗潜在靶点的价值，但其在CRC发生、发展中的作用机制仍有待进一步深入研究。