坤灵丸对卵巢储备功能下降患者体外受精-胚胎移植胚胎质量的影响

王海燕，邵小光，王美仙，黄杰，陶仕英，史艳彬，王磊，牛建昭，李健*（. 北京中医药大学中医学院组织胚胎学教研室，北京 040；. 大连市妇女儿童医疗中心（集团），大连 辽宁 6000）

近年来，体外受精-胚胎移植（IVF/ICSI-ET）应用于不孕不育患者使众多妇女成功妊娠。但卵巢功能是否正常对体外受精（IVF）妊娠率的影响较大。很多学者研究发现卵巢储备功能低下（DOR）的患者，其妊娠率低，周期取消率高。DOR指卵巢皮质区卵泡生长发育并形成可受精卵母细胞的能力，此能力取决于原始卵泡的数量和质量。若卵巢内可募集的卵泡数量减少或卵母细胞质量下降，配子生成功能下降，可致生育能力下降，称作卵巢储备功能减退，也叫卵巢储备功能下降。临床研究发现，DOR患者容易发生卵巢低反应性（POR），而且胚胎质量差，影响临床妊娠率，如何改善DOR患者的胚胎质量是如今研究的热点。

中医认为，DOR的主要病机是肾精不足、肾虚血瘀。中药坤灵丸是临床常用中成药，具有调经养血、逐瘀生新的作用，用于月经不调、宫寒、久不受孕、习惯性流产等的治疗。现代研究表明，坤灵丸其活血化瘀成分对于改善子宫动脉血流有一定的作用。子宫动脉的卵巢支供血卵巢，因此推测坤灵丸改善卵巢血供对提高卵巢功能可能有益。

本文采用随机对照方法，观察了坤灵丸对DOR患者IVF/ICSI-ET后胚胎质量的影响，探索针对DOR患者开展人工辅助生殖的预处理策略，为坤灵丸在临床的应用提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 DOR患者的纳入/排除标准

纳入标准：患者年龄25～42岁（包括25及42岁）；符合博洛尼亚DOR诊断标准[自然周期双侧卵巢窦卵泡（AFC）＜7个和/或抗苗勒氏管激素（AMH）＜1.1 ng·mL]，且治疗前3个月均未使用任何改善卵巢储备功能的药物治疗。

排除标准：排除染色体核型异常、生殖器官畸形、手术切除单侧卵巢、肿瘤放疗化疗术后患者；排除早发型卵巢储备功能不全（POI）及卵巢早衰（POF）患者。

1.2 研究对象

本研究经大连市妇女儿童医疗中心伦理委员会批准（批准文件号：2020010）。纳入2020年1月至2021年4月于本中心就诊行IVF/ICSI-ET助孕的DOR患者，共100例，随机分为两组：坤灵丸组和对照组，各50例，对DOR患者IVFET治疗后的采卵后各项指标情况进行观察。坤灵丸组脱落4例（不能按时服药3例，发热未采卵1例），对照组脱落1例（发热未采卵）。坤灵丸组和对照组分别含46例和49例DOR患者，采集静脉血及进行超声AFC监测。坤灵丸组口服坤灵丸15丸Bid，用药两个月经周期后来月经第3～5日进行拮抗剂促排，并继续口服坤灵丸至采卵日。对照组应用拮抗剂方案促排卵。分析坤灵丸组及对照组DOR患者的激素水平变化、获卵数目、2个原核（2PN）受精数目，2PN受精率、可利用胚胎数目、优质胚胎数目、优质胚胎率及注射绒毛膜促性腺激素日（hCG日）E浓度。

1.3 试药和仪器

三维彩超（美国Voluson E8，GE）。三气细胞培养箱（德国Labotect C200），所有胚胎使用一步培养液（美国globaltotal LP）培养，2PN胚胎培养至第3日（D3，采卵日为D0）移植或冷冻。Leica DM 2500显微镜（德国徕卡公司）。BCS196低温冷台（Linkam Scientic Instruments，英国）。

坤灵丸[天津天士力（辽宁）制药有限责任公司，浓缩丸，规格：0.125 g/丸]。尿促性素（hMG，75 U/支，丽珠集团丽珠制药厂），果纳芬注射液（450 U/支，默克雪兰诺），西曲瑞克（0.25 mg/支，默克雪兰诺），醋酸加尼瑞克（0.25 mg/支，默沙东公司）。绒毛膜促性腺激素（hCG，丽珠集团丽珠制药厂），醋酸曲普瑞林注射液（德国辉凌制药有限公司，0.1 mg/支）。

1.4 促排方案

来月经第2～4日开始应用hMG或果纳芬注射液150～300 U促排，卵泡在12～14 mm时根据黄体生成素水平应用拮抗剂注射用西曲瑞克0.25 mg或注射用醋酸加尼瑞克0.25 mg。优势卵泡至17～20 mm时，应用注射用hCG 10 000 U或醋酸曲普瑞林注射液0.2 mg扳机，34～36 h采卵。采卵后第1日（D1）观察是否受精，D3观察胚胎质量。视情况选择胚胎冷冻或新鲜移植，移植后12～14 d观察是否受孕。

1.5 优质胚胎诊断标准

优质胚胎：D3 评估6细胞以上1～2级的优质胚胎为优质胚胎（来源于2PN），碎片小于30%的胚胎为可利用胚胎，可以进行移植或冷冻。可用胚胎：6细胞3级以上的胚胎，可以移植或冷冻。1级胚胎，卵裂球大小均等，透亮，无碎片；2级胚胎，卵裂球大小不均等和/或碎片率小于10%；3级胚胎，碎片率10%～50%；4级胚胎：碎片率＞50%。

1.6 统计学方法

采用SPSS 25.0软件进行统计分析。非正态分布的数据用中位数（四位间距）[M（P，P）]表示，组间比较采用Kruskal-Wallis检验。正态分布数据用均值±标准差（±

s

）表示，组间比较采用独立样本

t

检验，

P

＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患者一般资料比较

两组患者的年龄、基础雌二醇（E）、基础卵泡刺激素（FSH）、基础黄体生成素（LH）、抗苗勒氏管激素（AMH）以及体质量指数（BMI）均无显著差异（

P

＞0.05）（见表1）。AFC、促性腺激素（Gn）使用天数、Gn用量、受精方式、同型半胱氨酸差异均无统计学意义。

表1 两组患者一般资料比较[M(P，P)]
Tab 1 General data between the two groups [M (P，P)]

特征 坤灵丸组（n＝46） 对照组（n＝49） Z/χ2 P年龄/岁 女 36.5（32，39） 36（32，38） －0.665 0.506男37（33，39.5） 35（32，38） －1.57 0.116 BMI/（kg·m—2） 22.2（20.15，23.9） 20.85（19.38，25.5） －0.782 0.434不孕年限/年 2（1，4） 2.5（2，5） －1.258 0.208原发或继发不孕/例 原发 27 27 0.125 0.724继发 19 22受精方式/例 IVF 27 32 0.441 0.507 ICSI 19 17 AFC/个 4（3，5） 4（3，5.5） －0.782 0.434 AMH/（ng·L－1） 0.6（0.49，0.78） 0.69（0.47，0.95） －1.367 0.172基础E2/（pg·mL—1） 40.00（29.48，48.07） 47（33.59，63.93） －1.780 0.075基础FSH/（IU·L—1） 8.85（6.89，11.92） 8.48（6.98，11.67） －0.045 0.964基础LH/（IU·L—1） 4.34（3.18，7.16） 4.59（3.45，5.7） －0.424 0.671 PRL/（ng·mL—1） 13.54（10.86，20.83） 15.36（11.9，19.31） 0.385 0.700 CA125/（U·mL—1） 14.32（9.21，22.40） 18.11（14.14，26.31） －1.664 0.096同型半胱氨酸 7.35（6.13，9.05） 8（7，9.83） －1.654 0.098 Gn起始量/U 300（281.25，300） 300（225，300） －0.237 －0.813 Gn使用天数/d 9（8，10） 8.5（7，10） －0.928 0.354 Gn用量/U 2475（2006.25，3000） 2400（1968.75，3000） －0.636 0.524

2.2 坤灵丸组用药前后激素水平和AFC比较

坤灵丸组用药后 FSH、LH水平低于用药前（Z＝－3.202、－3.116，

P

＝0.001、0.002）。坤灵丸预处理前后E、AFC无明显区别（Z＝－0.551，－1.073，

P

＝0.582、0.283）。结果见表2。

表2 坤灵丸组用药前后激素水平和AFC比较
Tab 2 Hormone level and AFC in Kunling pill group before and after the treatment

注（Note）：与坤灵丸组用药后比较，＜0.05（Compared with the Kunling pill group after the treatment，＜0.05）。

时间 E2/（pg·mL－1） FSH /（IU·L－1） LH/（IU·L－1） AFC/个用药前 40.00（29.48，48.07） 8.85（6.89，11.91）* 4.34（3.18，7.16）* 4（3，5）用药后 36.35（32.82，45.85） 6.61（5.66，8.69） 3.23（2.34，4.38） 4（3，5）

2.3 两组实验室及临床结局分析

两组比较，获卵数目、2PN受精受精数目、可利用胚胎数目、2PN受精率、新鲜周期着床率、妊娠率、HCG日E差异无统计学意义（

P

＞0.05）。坤灵丸组优质胚胎数目和优质胚胎率大于对照组（

P

＜0.05），移植一次妊娠率（56.25%）略高于对照组（50%），但差异无统计学意义。结果见表3。

表3 两组患者实验室及临床结局比较[M(P，P)，(%)]
Tab 3 Laboratory and clinical outcomes of the two groups [M(P25，P75)，(%)]

项目 坤灵丸组（n＝46） 对照组（n＝49） Z/χ2 P获卵数目/个 4（2.75，5） 3（2，5） －0.751 0.453 2PN受精数目/个 2.5（2，4） 3（2，3） －0.498 0.619可利用胚胎数目/个 2.5（2，3.25） 2（1，3） －0.903 0.367优质胚胎数目/个 1（0.75，2） 0（0，1） －2.936 0.003 2PN受精率 72.32%（128/177） 69.66%（124/178） 0.303 0.582优质胚胎率 45.24%（57/126） 30.43%（35/115） 5.583 0.018新鲜周期着床率 29.82%（17/57） 29.41%（15/51） 0.192 0.661移植一次妊娠率 56.25%（18/32） 50%（14/28） 0.234 0.628 HCG日E2浓度/（pg·mL－1） 873.2（622.5，1103） 918.4（607.65，1396.00） －0.284 0.776

3 讨论

3.1 DOR西医治疗进展

DOR处于POI早期，无临床症状，只有生化水平的异常表现，是育龄期女性最常见的生殖内分泌疾病，DOR患者所占比例在门诊不孕女性中占约10%。妊娠需要优质的胚胎和良好的子宫内膜容受性，优质胚胎是妊娠发生的首要条件。由于DOR患者的异质性较高，有一部分患者因为没有高质量的胚胎而被迫取消移植周期。因此如何获得优质胚胎和良好的妊娠结局是研究的重点。轻度的卵巢储备功能减退可以通过增加Gn用量改善其临床妊娠结局；真正的POR或重度DOR，应用大剂量的Gn，即使加大Gn用量可募集到的卵子不仅数量少且质量较差，可移植胚胎数减少，妊娠率显著下降，卵巢强力刺激并不能改善重度DOR患者的结局。如何改善DOR患者的妊娠结局，成为了众多学者研究的热点。有学者研究了生长激素或抗氧化制剂辅酶Q10及硫酸脱氢表雄酮在DOR或POR患者IVF中的应用，发现其可以提高DOR患者的胚胎种植率及临床妊娠率，改善其IVF-ET结局。但缺乏大样本的临床对照研究，结果需进一步证实。也有学者研究雌激素、孕激素在POI和POF中的应用，有一定短期疗效，但会影响肝肾代谢能力，增加患癌风险及血栓风险等，长期应用具有诸多弊端。

3.2 坤灵丸用于IVF前预处理机制

当前西医试管婴儿技术的应用，为DOR患者带来了希望，但不同于卵巢储备功能良好的患者，DOR患者基础卵泡数目少，胚胎获得数目少，优质胚胎相对少。有时需要反复的控制性卵巢刺激（COS）以追求更多的获卵数和更多的胚胎，需多次采卵才能最大机会受孕。但这一治疗方案价格高昂，可控的个体化 COS 方案有限。拮抗剂（GnRH-A）方案近年被临床广泛应用，在POR患者中，GnRH-A和GnRH-a长方案对于IVF临床结局的影响无显著差异，GnRH-A方案可减少Gn用量，缩短Gn用药时间。因此本文DOR患者统一选用GnRH-A方案，对患者有益且能排除促排方案不均一的影响。在西医促排治疗的基础上用坤灵丸预处理，调节 H-P-O 轴以改善卵巢储备功能、提高卵巢反应性、减少激素药物的应用、从而增加妊娠率，临床效果好，不良反应少。坤灵丸由31味中药材组成，其中肉苁蓉、鹿角胶、地黄、龟甲胶、五味子起到补肝肾、益精血的作用。主要用于肾虚、气滞血瘀，但基本涵盖了不孕症的基本证型，可改善卵巢功能，提高子宫内膜容受性并具有调经养血、逐瘀生新的功效，在临床上用于促排卵、子宫内膜增生、卵巢早衰、降低IVF-ET流产率等。但尚无对DOR患者的IVF临床对照研究。

3.3 本文研究结果及文献回顾

本研究为前瞻性研究，结果显示两组基础内分泌情况差异均无统计学意义。坤灵丸组用药后FSH和LH水平低于用药前，提示坤灵丸能够调节激素水平，降低DOR患者FSH和LH水平。高FSH对胚胎质量有负面影响，降低基础FSH水平，预防卵泡早期发育，能使促排时卵泡更加同步。研究表明，基础FSH水平增高与获卵数、可利用胚胎数和移植胚胎数下降显著相关，与受精率和流产率无明显相关性。基础LH升高对促排过程及结局也有负面影响。外周血基础LH升高（≥10 U·L）主要见于两类患者，一类是临床常见的多囊卵巢综合征（PCOS）患者，另一类是卵巢功能低下或者衰竭的患者，以高龄或围绝经期女性多见。从分析的数据来看，对于基础LH水平过高（≥10 U·L）的患者，尝试使用全程拮抗剂平稳控制LH水平是可行的，可能有助于降低高危患者早发LH峰的风险，改善助孕结局。研究结果显示坤灵丸组获卵数目、2PN受精数、可利用胚胎数目、移植一次妊娠率略高于对照组，而优质胚胎数目和优质胚胎率显著优于对照组（

P

＜0.05）。有研究表明在补肾疏肝法的基础上适当加用活血药，可以改善血循环，增加卵巢血流量，还可以升高E、降低FSH及抑制颗粒细胞凋亡、促进血管生成，在增加卵巢指数方面均有明显的优势。尤昭玲等将 IVF-ET过程进行分期，并根据各期的临床特点，应用中医分期辅助治疗，发现采用相应的中药口服，能收集到足够数量的优质卵细胞，提高胚胎的质量，提高子宫内膜对胚胎的容受性，达到提高临床妊娠率和活产率的目的。张宁发现在 IVF-ET 治疗前3个月，口服补肾化痰中药能提高优质胚胎率、临床妊娠率，降低卵巢过度刺激综合征的发生率。动物实验发现应用中药方剂对DOR大鼠的卵巢功能具有保护作用。坤灵丸在大鼠胚胎-胎仔发育的药理毒性实验研究表明，相当于人类口服剂量43.2倍的剂量对大鼠母体及胎仔无明显影响。因此，坤灵丸应用于临床安全可靠。

综上所述，坤灵丸对于提高优质胚胎数目及优质胚胎率有帮助。在IVF应用拮抗剂的基础上预先应用坤灵丸，尽管没有提高获卵数目，妊娠率无显著性差异，但是能显著提高优质胚胎率，而且安全性高。下一步将增大样本量，统计累计妊娠率和活产率，对坤灵丸提高DOR患者优质胚胎质量的分子机制进行深入探讨。