顶空气相色谱法测定人干扰素α2b原液中乙腈残留量

冯雪 李野 刘华 李婷婷 王佳欣 杨红育

（长春生物制品研究所有限责任公司 吉林长春 130012）

1 前言

人干扰素α2b原液是用于配制人干扰素α2b类疫苗的中间产品，根据《中国药典》（2020年版）三部，原液在制备过程中需采用有机溶剂乙腈作为纯化过程的流动相，用以除去原液中的相关蛋白。根据《中国药典》（2020年版）通则0861残留溶剂测定法的要求，乙腈属于第二类溶剂，应当限制使用，其限度为0.041%[1]。本文对此开展研究，以建立人干扰素α2b原液中乙腈残留量的测定方法，并对该方法的系统适用性、重复性、准确性、中间精密度、检测限和定量限进行验证。

2 材料与仪器

2.1 材料

人干扰素α2b原液（长春生物制品研究所有限责任公司）；空白溶液（长春生物制品研究所有限责任公司）；乙腈标准品（纯度：99.64%，批号：G1029269，Dr.Ehrenstorfer）；实验用水为超纯水。

2.2 仪器

气相色谱仪（Agilent7890A型，配FID检测器和Agilent7697A型顶空进样器）；电子天平（XS205型，METTLER）；超纯水仪（SynergyUV型，Millipore）。

3 方法与结果

3.1 色谱条件

色谱柱：Agilent HP-FFAP毛细管柱（25 m×0.320 mm，0.50 μm）；载气：高纯氮气；流速：1.0 mL/min；柱温：60℃；检测时间：10min；进样口温度：150℃；检测器：FID；温度：300℃；顶空进样平衡温度：70℃；平衡时间：20 min；分流比：10∶1。

3.2 标准溶液、供试品溶液、空白溶液的制备

3.2.1 0.000 4%标准溶液的制备

取乙腈标准品0.1 g，精密称定，置于含50 mL超纯水的100 mL量瓶中；加入超纯水，稀释至刻度，摇匀；量取0.4 mL上述溶液，置于含50 mL超纯水的100 mL量瓶中；加入超纯水，稀释至刻度，摇匀，即得0.000 4%标准溶液。

精密量取0.000 4%标准溶液1 mL，置于10 mL顶空瓶中，压盖密封，作为标准溶液。

3.2.2 供试品溶液的制备

精密量取人干扰素α2b原液1 mL，置于10 mL顶空瓶中，压盖密封，作为供试品溶液。

3.2.3 空白溶液

精密量取空白溶液1 mL，置于10 mL顶空瓶中，压盖密封，作为空白溶液。

3.3 方法学考察

3.3.1 系统适用性试验

按照3.1项色谱条件，分别对0.000 4%标准溶液、空白溶液及供试品溶液进行分析，记录色谱图。结果表明，空白溶液对被测组分无干扰；以乙腈色谱峰计算，理论板数≥5 000，分离度＞1.5，符合《中国药典》（2020年版）通则0861残留溶剂测定法中系统适用性试验的要求，色谱图见图1。

图1 标准品溶液（A）、空白溶液（B）及供试品溶液（C）的气相色谱图

3.3.2 重复性试验

取同一供试品溶液，按照3.1项色谱条件进行分析，连续进样6次，记录色谱图。按外标法计算乙腈的残留量，结果显示，平均残留量为0.000 410 61%，RSD为2.31%（n=6）。表明该方法的重复性良好，测定结果见表1。

表1 重复性测定结果

3.3.3 中间精密度试验

在不同时间，由不同检测人员按照3.1项色谱条件，对同一供试品溶液进行分析，每位检测人员分别检测6次，记录色谱图。按外标法计算乙腈的残留量，2位检测人员的平均结果为0.000 398 4%，RSD为4.31%（n=12），测定结果见表2。

表2 中间精密度测定结果

3.3.4 回收率试验

根据3∶7、5∶5、7∶3的比例，量取0.000 4%乙腈标准溶液及供试品溶液，混匀；分别量取上述溶液各1ml，置于10ml顶空瓶中，压盖密封；按照3.1项色谱条件，将每种比例的溶液连续进样3次，记录色谱图。按外标法计算，乙腈的回收率在87.04%～101.98%之间，测定结果见表3。根据《中国药典》2020年版通则9101分析方法验证的指导原则，待测定成分含量为0.001%时，其回收率限度参考值为80%～115%，在基质复杂、组分含量低于0.01%及多成分等分析中，回收率限度可适当放宽[1]。试验结果表明，该方法准确度较高，符合《中国药典》的规定。

表3 回收率测定结果

3.3.5 检测限和定量限测定

取0.000 4%乙腈标准溶液，加入适量超纯水，将标准溶液逐级稀释；按照3.1项色谱条件进行测定，以信噪比约为3∶1时相应的浓度作为检测限，以信噪比约为10：1时相应的浓度作为定量限。经测定，检测限为0.000 004%，定量限为0.000 02%，测定结果见表4。

表4 检测限及定量限测定结果

4 讨论

4.1 顶空平衡温度与平衡时间的选择

根据《中国药典》（2020年版）通则0861残留溶剂测定法，以水为溶剂时，顶空瓶平衡温度为70℃～85℃，顶空瓶平衡时间通常为30～60 min，结合所查阅的文献[2-7]，本文选择70℃作为顶空进样的平衡温度。在此温度条件下，分别考察了平衡时间为20 min、30 min、40 min、50 min、60 min对测定结果的影响。结果表明，乙腈残留量基本无变化，故本文最终选择70℃作为顶空进样平衡温度，20 min作为顶空进样平衡时间。

4.2 分流比的选择

本文考察了不同分流比（5∶1、10∶1、20∶1）对试验结果的影响，结果表明，乙腈残留量基本无变化，故本试验选择10∶1作为分流比。

4.3 乙腈残留量监测的意义

根据《中国药典》（2020年版）通则0861残留溶剂测定法的要求，乙腈作为第二类溶剂，应该限制使用，并将其限度定为0.041%。本文建立了简便、快捷、准确的方法，可用于测定人干扰素α2b原液中乙腈的残留量，能够为人干扰素α2b原液的质量控制提供技术参考。