黄柏主要成分及其鉴定技术研究进展

乔路苹, 刘偲, 康良, 孟长来

1. 成都体育学院 a. 经济管理学院, b. 运动医学与健康研究所，四川 成都 610041,2. 四川省林业和草原科学技术推广总站，四川 成都 610081,3. 森林和湿地生态恢复与保育四川省重点实验室，四川省林业科学研究院，四川 成都 610081

以黄柏为代表的黄檗属植物具有重要的科学价值、药用价值和经济价值。因栖身植被丧失和过度利用,相关野生种群急剧减少，目前已被列为国家二级保护树种[1-2]。在研究与开发方面，虽然成分含量及GAP标准已建立，但野生资源减少、成材周期较长、市场需求增多等供需矛盾仍然导致市售药材质量参差不齐；加之监管力度和手段不完善，使得伪、仿、劣质品混杂其中[3]。因此，需在明确既有主要成分及其含量标准的基础上，运用简便、廉验、快速的技术手段继续开展对市售黄柏及其制品的鉴定与质控工作。另一方面，与其它大多数来源于天然产物的中药材情况相似[4]，黄柏药材及其炮制品的成分较为复杂；仅围绕一两种主要成分作为标准化指标、进行含量检测，将面临有效性和特异性不足的问题。因此，借助新兴技术手段、获取更丰富的成分特征信息，对黄檗属植物的鉴定工作也具有科研和应用价值[5]。

1 黄柏资源分布与成分规定

1.1 资源分布

黄檗属（Phellodendron）植物是我国重要的经济、药用树种之一，属于芸香科阔叶乔木。据2020版《中华人民共和国药典》（以下简称《药典》）记载，黄皮树（P.chinense Schneid.）和黄檗（P.amurense Rupr.）的干燥树皮，作为常用的中药材，分别被称为“黄柏（川黄柏）”和“关黄柏”[6]。

黄檗属植物在中国的地理分布具有一定规律。有研究者通过GMPGIS系统进行生态因子分析发现，川黄柏集中分布在亚热带季风气候区，属于亚热带常绿阔叶林区，零星分布在热带季风和暖温带；关黄柏集中分布在温带季风气候区，属针阔叶混交林、温带落叶阔叶林、温带草原区，部分分布在温带大陆性气候区域。其中，我国川黄柏的生态适宜面积最大，主要集中在南方省市，如四川、云南、贵州、重庆、湖南、湖北等地，其中四川占据全国川黄柏总产量的60—70%；关黄柏生长适宜区则主要集中在我国北方，如黑龙江、河北、山西、内蒙古、陕西等地，其中黑龙江占据全国关黄柏生态适宜面积的30%[7]。目前，关于野生黄檗属植物种群结构及空间分布的研究仍相对较少。故有学者提出，应重视对不同地理黄檗种群群落特征的研究及比较分析，加强黄檗天然林遗传多样性、群体遗传结构、种质鉴定评价等研究，促进种质资源的保护利用和良种选育工作[8]。另有研究者认为，应尽快建立黄檗专门保护区，确保遗传多样性；加强黄檗繁殖生物学研究，建立人工繁育基地，扩大黄檗种群规模[1]。

黄檗种群的产地差异直接影响药材成分。有学者对不同产地来源的30份黄柏样品进行了主要成分含量测定，发现不同产地样本的生物碱含量差异较大，部分地区不含或仅含少量药根碱和巴马汀，四川产区黄柏的小檗碱和黄柏碱含量高于其他产区；而在同一样品中，木兰花碱、黄柏碱、药根碱、巴马汀、小檗碱含量也差异较大，其中小檗碱含量最高[9]。后继不同产地研究也确认，川黄柏的盐酸小檗碱含量最高，药根碱和巴马汀含量较低，关黄柏的盐酸小檗碱含量低于川黄柏[10]。与采收期有关的研究发现，花果期雌株黄柏小檗碱含量显著下降，提示在不同生长发育期中，碳和能源物质的分配变化也影响着黄柏成分含量。有关采收年限的研究表明，采收年限越晚、小檗碱含量越高[11]。针对川黄柏不同部位的研究发现，树皮的盐酸小檗碱含量显著高于幼叶和老叶[12]，推测这可能是川黄柏以树皮入药的重要依据[13]。可见，在不同产地、品种、采收期、年限乃至部位的黄檗属药材中，小檗碱的成分含量差别较大[14]，这可能是导致相应药材质量和功效存在差异的重要原因。因此，有必要在明确黄檗属药材主要成分的基础上，运用有效的技术手段开展药材及其制品的鉴定工作。

1.2 成分规定

2005版《药典》将“关黄柏”从“黄柏”中分出、列为两种药材以免混淆，并对二者的主要成分盐酸小檗碱含量进行了明确规定，川黄柏含量的最低标准是关黄柏的五倍[15]。2010版《药典》则修订了“关黄柏”“川黄柏”主要成分及含量测定标准，分别将盐酸巴马汀、盐酸黄柏碱纳入二者的成分含量规定中；同时，炮制方法的不同会导致成分含量与药效产生较大差异，故该版《药典》也将黄柏的相应炮制品单列，分别制定了标准[16]。2015、2020版《药典》则一直沿用了该标准（见表1）。作为道地药材来源地，四川荥经地区的川黄柏产量和盐酸小檗碱含量均明显高于四川其它地区，并已建立川黄柏规范化种植（GAP）基地[17]。因盐酸小檗碱含量远高于关黄柏，川黄柏的成分鉴定与相关技术研究一直是该领域关注的重点。

表 1 《中国药典》对黄柏成分规定变化一览表Tab. 1 Component standard changes of Phellodendron herbs regulated by Chinese Pharmacopoeia

2 黄柏成分鉴定方法

2020版《药典》中，对多成分进行测定、质控的中药品种已逾百种，中药鉴定与质控工作已逐渐由单一化学指标向多成分整体模式转变。中药指纹图谱技术作为公认的药材质控手段之一，是鉴别真伪、区分物种、评价优劣、确保中药材一致性和稳定性的有效方法[18]，主要技术手段包括了色谱、电化学、光谱和DNA、基因组学等多种测定方法。近年来，国内先后单独或联合运用薄层色谱法（TLC）、高效毛细管电泳法（HPCE）、DNA条形码、高效液相色谱法（HPLC）、光谱法等技术，围绕川黄柏、关黄柏的指纹图谱特征进行了相关研究，取得了系列成果[19-24]。

2.1 薄层色谱技术（TLC）

有研究者开展了复方黄柏凝胶质量标准研究，先通过高效液相色谱法建立了复方黄柏凝胶指纹图谱，后采用TLC法对黄柏及盐酸小檗碱进行定性鉴别。结果发现，复方黄柏凝胶比复方黄柏液涂剂质量更优[25]。另有学者发现TLC法可用于鉴别健脾利湿和胃膏中的黄柏，并认为该方法的准确性、专属性和重现性均较好[26]。TLC法作为一种快速分离和定性分析少量物质的技术，常用于鉴别药品、测定含量或检查杂质，也可用于跟踪反应进程。但是，TLC法仅靠单一成分评价模糊了中药整体特征，且对点样过程和展开均有较高的技术和条件要求，某种程度上影响了该技术的推广，其在黄柏领域的应用研究也相对缺乏[27-28]。

2.2 高效毛细管电泳技术（HPCE）

有学者采用HPCE法、以黄连碱为内标测定了黄柏干皮和枝皮中盐酸小檗碱的含量，发现黄柏不同部位的盐酸小檗碱含量有明显区别，其中干皮为4.06%、枝皮为3.41%[29]。有研究者借助非水毛细管电泳法，测定了不同产地川黄柏和关黄柏饮片中的盐酸小檗碱、药根碱、木兰碱和盐酸巴马汀含量[30]；另有学者采用NACE-DAD指纹图谱对不同产地黄柏进行了质控分析[31]。两项产地研究均发现，相关技术可对不同产地黄柏进行质控，但电泳条件较高、需重复优化，且实验过程较繁琐。

HPCE作为一种高效分离分析技术，具有分离模式多、量微、快速、溶剂消耗少、成本低、易清洗等优点，尤适于生产和保存过程中无机离子和小分子有机酸的含量测定；但使用时需严格控制缓冲液pH值和电泳温度，对实验技术要求较高，否则进样时容易引发误差，这在一定程度上影响了实验结果的稳定性和重复性[32-34]。

2.3 DNA条形码技术

围绕黄柏类药材的DNA条形码鉴定领域，有研究人员应用ITS2序列，鉴定了市售黄柏药材及其混伪品,发现该技术可准确有效地将川、关黄柏与其各自混伪品进行区分；但无法将川、关黄柏两种药材进行区分[35]。另有研究者将ITS、psbA-trnH序列作为候选基因片段，发现psbA-trnH比ITS具有更好的鉴定效能；psbA-trnH和ITS+psbA-trnH均能将关黄柏从川黄柏、秃叶黄皮树中区分开，但无法区分川黄柏和秃叶黄皮树，提示关黄柏的DNA条形码特征差异性可能更为明显；同时，利用ITS序列的第173位点和psbA-trnH序列的第206位点、第397位点等三个SNP位点，可以快速准确地鉴别黄柏类药材的三个基源植物。该研究进一步指出，黄柏类药材DNA条形码鉴定数据库的建立，至少需满足在整个分布区内随机采集12个种群、每个种群取1—2个样本，方可代表关黄柏的遗传多样性水平，从而保证DNA条形码数据库的应用可靠性[36]。另有科研人员分析了不同产地关黄柏的DNA多态性，并据此构建了关黄柏DNA植物图谱，建立了优化的关黄柏总DNA提取及AFLP分析体系，该体系适用于关黄柏遗传多态性分析、结果重现性好；该研究还从64对引物组合中、筛选得到了多态性高的10对，针对其他来源的道地与非道地关黄柏样本，可直接开展分析[37]。

上述研究为黄檗属药材的产地鉴别、资源保护工作提供了重要参考依据。同时，既有成果报道多集中于关黄柏领域，川黄柏的相关技术研究仍有待进一步探索和发展。DNA条形码是基于基因芯片、高通量测序等现代生物技术的衍生产物，被视为前景广阔的新兴技术，目前尚需要配套的技术条件（如较完备的分子生物实验平台）；另一方面，样本的快速制备和快速分析是多数生物技术的主要瓶颈，这也有望成为DNA条形码技术未来着力解决的重要方向[38-40]。

2.4 高效液相色谱技术（HPLC）

有研究者采用HPLC法分别测定了关黄柏和川黄柏中的黄酮含量，以流动注射化学发光法测定了关黄柏和川黄柏的抗氧化性，并进行了两种药材的比较。发现关黄柏和川黄柏中的黄酮含量变异系数相同；川黄柏的回收率、黄酮含量均高于关黄柏；川黄柏抗氧化性的IC50（抑制率为50%时的溶液的浓度）则低于关黄柏，说明川黄柏中黄酮化合物含量和抗氧化性均高于关黄柏[41]。另有研究人员采用超高效液相色谱法、同时测定了川黄柏和关黄柏中小檗碱、黄柏碱、巴马汀、木兰花碱的含量。通过计算峰面积比值R1（木兰花碱/黄柏碱）、R2（巴马汀/小檗碱），认为R1＜1、R2＜0.05可视为川黄柏的判定特征；R1＞1、R2＞0.05则为关黄柏的特征。提出该方法可用于黄柏、关黄柏的鉴别以及相关中成药的定性鉴别[42]。有团队采用HPLC法，对川黄柏不同炮制品中的盐酸小檗碱进行了含量测定，发现该方法简单易行、结果准确；同时发现，川黄柏经清炒后、小檗碱含量可达10.989 mg，高于其它炮制品，相关研究有望为川黄柏炮制品的临床应用提供数据支持和参考[43]。此前，有学者对不同购买地的十批黄柏生品、盐炙品、酒炙品、蜜炙品进行了显微及TLC法鉴别，并结合HPLC法进行了含量测定。发现结果重复性好、稳定性强，可较好用于黄柏及其不同炮制品的质控[44]。有学者则对HPLC进行了优化，旨在更好测定川黄柏结晶物中的盐酸小檗碱含量。结果表明，优化条件后的精密度相对标准偏差（RSD）为0.49%、重复性为1.23%、稳定性为0.29%；平均加样回收率为97.84%～98.06%，RSD为0.44%～1.00%。认为该优化方法安全、快速、精确、有效[45]。还有研究人员用HPLC法检测了黄柏药材中非法染色剂的添加情况，在30批样品中、检测出2批含有非法添加剂金胺O，体现了该方法简便准确、专属性强，尤适于药材质量监测工作[46]。

HPLC是构建中药指纹图谱的经典技术手段，在黄柏产地和成分含量研究中取得了大量成果。但其分析时间长、只能检测几种有限的主要成分。因此，对于以黄柏为代表的、成分复杂的天然产物进行鉴定和质控，仍需结合快速、灵敏度高的方法[47-50]。

2.5 光谱法

我国05版《药典》即对光谱技术在药材质量鉴定等方面的应用作出了指导。目前，已有研究人员利用近红外光谱，开展了黄柏主要成分及含量的相关研究。有学者以HPLC所测川黄柏样品中的小檗碱和黄柏碱含量为参考值、并与样品的近红外光谱进行关联,经偏最小二乘法（PLS）建立了川黄柏中小檗碱和黄柏碱的定量分析模型。结果发现，所建立的小檗碱定量分析模型性能指数PI为95.6；黄柏碱为93.5，说明该方法能同时无损快速测定川黄柏中的小檗碱和黄柏碱含量[51]。另有研究者围绕川黄柏中3个成分（木兰花碱、黄柏碱、小檗碱）、以HPLC测定的黄柏生物碱含量作为参照值，结合采集到的49批不同产地川黄柏样品的近红外漫反射光谱，经PLS建立校正模型，比较了不同预处理方法及不同波段对建模的影响。结果发现，以MSC+2D2为预处理方法、建立的小檗碱、黄柏碱、木兰花碱近红外光谱模型稳定准确可靠，相关系数（R2）分别为0.9995、0.9760、0.9306，适用于快速检测[52]。有研究者通过获取不同产地黄柏及其伪品的近红外漫反射光谱，用模式识别方法进行了聚类分析，建立判别模型后，用三重交叉验证模型稳定性。发现同产地、不同批次的样品聚类效果较好，为光谱技术鉴别黄柏产地提供了新方法[53]。另有学者用傅里叶变换红外光谱仪，获取6个产地黄柏的红外光谱并结合主成分分析模型，发现可基本有效区分不同产地来源的样本，并在一定程度上能分析样本的亲缘关系[54]。

作为中药指纹图谱技术中鉴定、评价与质控的关键手段，光谱技术具有快速高效、无污染、样品用量小、灵敏度高等特点。作为经典光谱手段之一，近红外光谱常用于表征含氢原子的官能团，如醇、酚、胺和碳氢化合物等，适合对较复杂的化合物进行分析。近红外光谱技术已在中药领域广泛应用并在黄柏研究领域崭露头角[5,55-56]，如与其它新兴技术结合，则有望为黄柏产地鉴定与成分测定研究提供更多成果。

3 展望

作为临床常用中药，黄柏主要含有蛋白质、糖类、脂类、生物碱类、黄柏酮、甾醇类等多种物质，这些物质直接影响着黄柏的质量和药效。在前述成分鉴定技术中，光谱法在黄柏领域应用相对较少，但其可提供不同波段中药物质分子的转动或振动信息；且属于快速低耗、样本用量少、操作简便、灵敏度高、有效性好的鉴定技术，具有广阔的应用前景。

具体光谱技术中，红外、紫外等方法在中药领域应用较广泛。通常情况下，有机分子内化学键的振动吸收频率主要在红外波段。在红外光谱中，近红外区在研究含氢原子的官能团，如醇、酚、胺和碳氢化合物等时比较重要[57]；中红外区是红外光谱中应用最早和最广的一个区，也是鉴定化合物和确定分子结构的常用谱段[58]；远红外区则有利于观察重原子之间的伸缩和弯曲振动、晶格振动、分子间氢键振动、有机分子较弱的相互作用等[59]；太赫兹区则对于物质结构的理解具有重要意义。故理论上，绝大部分中药均可能存在特征性的多谱段指纹光谱[60]。

因此，如着眼于黄柏成分研究与市场需求，将实地采样与以光谱法为代表的新兴鉴定技术相结合、丰富和改进现有成分鉴定技术，对于完善黄柏质量标准、产地保护和规范化种植都将具有推动作用。