抗癌防移片对大肠癌肝转移小鼠血清肝细胞生长因子、血管内皮生长因子表达的影响

郭忠聪，龚 纯

(湖南中医药大学第一附属医院肿瘤科，湖南 长沙 410007)

大肠癌(Colorectal cancer，CRC)是消化道恶性肿瘤之一，发病部位为结肠、直肠。大肠癌的发病率和病死率均较高，五年生存率低，是全球第三大恶性肿瘤[1]，严重威胁人类生命健康。饮食结构不合理、饮食不规律、作息时间紊乱、过度肥胖、大量饮酒、吸烟等均是大肠癌的危险因素[2-3]。近年来，随着人们生活方式、饮食结构的改变，我国流行病学调查显示大肠癌发病率急剧上升[4]。目前，大肠癌常按照肿瘤分期选择治疗方式，包括外科手术切除治疗、化学药物治疗、物理放射治疗、靶向药物治疗、免疫药物治疗、中医中药治疗等。虽然，近年来多学科会诊模式逐渐兴起，药物临床研究日益丰富，但是大肠癌术后五年生存率仅约50%[5-6]。肝转移是大肠癌患者死亡的主要原因，约50%的大肠癌患者发生肝转移[7-8]，发生肝转移者中位生存期仅为6～12个月[9]。综上所述，探究大肠癌肝转移发病机制及有效防治策略意义深远。

大肠癌属中医“肠覃”“脏毒”“锁肛痔”等病症范畴。《医宗金鉴》中论述：“此病有内外阴阳之别”，说明大肠癌病因复杂，与饮食不节、邪毒内侵、情志不遂、脏腑虚损等因素相关，正虚为本、湿热瘀毒为标是大肠癌的病机特点，其局部以湿热瘀毒为主，属实，整体以脾肾亏虚为主，属虚。抗癌防移片系三湘名医经验方，以健脾补肾、化瘀解毒为法组方而成。近年来，本课题组临床运用抗癌防移片防治常见恶性肿瘤的复发转移，收获满意的临床疗效。前期临床研究显示，抗癌防移片联合化疗不仅可提高大肠癌肝转移患者的疾病缓解率，还可降低Ⅲ期结肠癌术后患者的复发转移率[10-11]。本研究预实验显示抗癌防移片可降低结肠癌模型小鼠肝转移发生率，但其具体机制尚不明确。本研究以结肠癌肝转移裸鼠模型为研究对象，以血清肝细胞生长因子(HGF)、血管内皮生长因子(VEGF)为切入点，研究抗癌防移片抗大肠癌肝转移的分子机制，报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物及细胞 SPF级雄性ICR小鼠50只购买于湖南斯莱克景达实验动物有限公司，体重20～25 g。动物许可证号[SCXK(湘)2016-0002]，实验单位使用许可证号[SYXK(湘)2015-0003]，动物实验伦理批号(ZYFY20190920)。饲养环境：温湿度适宜，昼夜各12 h的SPF级动物房。小鼠结肠腺癌细胞株(CT26)购自Procell公司。

1.2 实验药物 抗癌防移片由湖南中医药大学附属第一医院药剂科生产，组方包括红参、半枝莲、黄芪、薏苡仁、姜黄、女贞子、墨旱莲、莪术、九香虫、枸杞子、白术、湘曲。

1.3 实验试剂 HGF、血管内皮生长因子-A(VEGF-A)ELISA检测试剂盒购自上海晶天生物科技有限公司；胎牛血清(批号NVW0526)购买自浙江天杭生物科技有限公司；PBS粉(批号ZLI-9062)购买自北京中杉金桥生物技术有限公司；进口石蜡购买自德国徕卡仪器有限公司；苏木素溶液和伊红溶液购买自美国Sigma公司。

1.4 实验仪器 洁净工作台(苏净集团安泰公司)；TP-2000E型电子天平(湖南湘仪仪器有限公司)；DW-HL-3985型美菱超低温冰箱(中科美菱低温科技股份有限公司)；倒置显微镜和照相装置(日本OLYMPUS)；Z32HK台式高速冷冻离心机(杭州英斯特科技有限公司)；KS400型图像分析仪(德国ZISSE)；BM-VⅡ型生物组织包埋机(冷台)(孝感市宏业医用仪器有限公司)；3050S型冷冻切片机(德国徕卡有限公司)；液氮罐(成都金凤液氮容器有限公司)。

1.5 实验方法

1.5.1 细胞株的制备：常规培养CT26细胞于含10%胎牛血清的RPMI1640营养液。取对数生长期的细胞，消化吹打成单细胞悬液，1000 r/min离心5 min，弃上清液，加适量不含血清的RPMI1640营养液调整细胞浓度至2×106个/ml。

1.5.2 模型制备：造模前小鼠禁食不禁水12 h，腹腔注射5%水合氯醛5 mg/kg麻醉，于背侧中部、左侧腋中线与腋后线间，取1.5 cm左右切口进腹，显露脾脏。模型组用1 ml注射器于脾脏上极沿脾脏纵轴进针，边退边注入50 μl的CT26细胞悬液(2×106个/ml)。在注射部位可见脾被膜发白、肿胀，慢慢旋出针头，立即用蘸有碘伏的消毒棉签止血按压3 min，观察无活动性出血后，将脾脏送回腹腔，关腹，先缝合肌肉层，再缝合皮层。

1.5.3 分组与给药：50只小鼠适应性喂养1周后，随机选取10只为假手术组，剩下40只小鼠制备大肠癌肝转移模型。造模后1周，选取30只造模成功的小鼠，随机分为模型组、抗癌防移片高剂量组、抗癌防移片低剂量组，每组10只。抗癌防移片高、低剂量组分别给予2、1 g/ml抗癌防移片混悬液灌胃，假手术组、模型组给予等体积0.9%氯化钠溶液灌胃，1次/d，连续给药4周。

1.5.4 样本采集：末次给药后，禁食不禁水12 h，眼球取血于1.5 ml的EP管中，室温静置4 h，4500 r/min离心10 min，取上清液于新的EP管中，超低温冰箱保存备用。取血后开腹，各组小鼠取同位置大肠2～3 cm和肝脏组织，0.9%氯化钠溶液清洗后，4%多聚甲醛固定，待测。

1.5.5 一般情况和体重变化：观察比较各组小鼠造模前及给药期间精神状态、毛发、行为活动、二便等，观察各组小鼠给药期间体重变化和肝脏瘤体重量。

1.5.6 ELISA法检测血清CA199、CEA、HGF、VEGF-A水平：取超低温冰箱保存的血清样本，按照试剂盒说明书操作，用酶标仪在450 nm波长下测定吸光度，通过标准曲线计算样品中CA199、CEA、HGF、VEGF-A浓度。

1.5.7 大肠及肝脏的病理学改变：多聚甲醛固定包埋大肠及肝脏组织，流水冲洗组织中残存的多聚甲醛，梯度乙醇脱水，彻底脱水后浸入无水乙醇，浸蜡包埋，切成厚度为4 μm的切片，展片、捞片、烤片、脱蜡、乙醇浸入，采用中性树胶封片，在光镜下观察、拍照。

1.6 统计学方法 采用SPSS 27.0统计学软件进行分析。计量资料以均数±标准差表示，组间和组内不同时间点均数比较采用单因素方差分析，组间同一时间点均数比较采用t检验；P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组小鼠一般情况观察 造模前，各组小鼠精神状态佳，行为活动、饮食饮水及二便均正常，毛发有光泽。造模1周后模型组和抗癌防移片高、低剂量组小鼠逐渐出现腹胀、毛发枯糙、体形消瘦、行动迟缓、大便稀溏、小便发黄等。给药后24～28 d，模型组、抗癌防移片低剂量组小鼠食欲减退、体重明显下降、毛发脱落、大便溏薄、静卧不动，抗癌防移片高剂量组小鼠精神状态较低剂量组明显改善。假手术组小鼠在实验期间一般情况无明显变化。

2.2 各组小鼠体重比较 见表1。给药前及给药1周，各组小鼠体重比较差异无统计学意义(P>0.05)；给药2、3、4周，与假手术组比较，其余各组小鼠体重均明显下降(P<0.05)，其中模型组下降最显著，组间比较差异具有统计学意义(P<0.05)。

表1 各组小鼠体重比较(g)

2.3 各组小鼠肝脏瘤体重量比较 见表2。与模型组小鼠比较，抗癌防移片高剂量组肝脏瘤体重量降低(P<0.05)。

表2 各组小鼠肝脏瘤体重量比较(g)

2.4 各组小鼠血清CA199、CEA水平比较 见表3。与假手术组比较，模型组小鼠血清CA199、CEA水平均明显升高(P<0.05)。与抗癌防移片高剂量组比较，抗癌防移片低剂量组及模型组小鼠血清CA199、CEA水平均明显升高(P<0.05)。

表3 各组小鼠血清CA199、CEA水平比较

2.5 各组小鼠血清HGF、VEGF-A水平比较 见表4。与假手术组比较，抗癌防移片低剂量组及模型组小鼠血清HGF、VEGF-A水平均明显升高(P<0.05)，抗癌防移片高剂量组小鼠血清VEGF-A水平明显升高(P<0.05)。与模型组比较，抗癌防移片高剂量组小鼠血清HGF、VEGF-A水平均明显降低(P<0.05)。

表4 各组小鼠血清HGF、VEGF-A水平比较(pg/ml)

2.6 各组小鼠大肠及肝脏组织病理改变 见图1。假手术组大肠及肝脏组织未见肿瘤细胞，细胞形态规整。与假手术组比较，模型组小鼠肠上皮可见明显的腺癌细胞分布，肿瘤细胞异型性明显，数量、大小结构不一，部分呈实性团块或小条索状排列，可见腺腔形成，部分排列成管状或腺样结构。肝脏组织可见单个或多个结节，HE染色后，大小形态不一，异型性明显，细胞核增多，可见病理性核分裂，与肠上皮病灶形态类似。与模型组比较，抗癌防移片高剂量组小鼠肠上皮可见腺癌细胞分布，肝脏组织可见散在小结节，HE染色后，与肠上皮病灶形态类似。与模型组比较，抗癌防移片高剂量组小鼠大肠及肝脏组织未见明显的肿瘤细胞，细胞形态较为规整。提示抗癌防移片具有一定的抑制大肠癌肝转移的作用。

3 讨 论

肿瘤的生长和转移需要充足的养分，与周围新生血管的形成密切相关[12-14]。肿瘤新生血管的形成取决于局部微循环中血管生成促进因子和血管生成抑制因子[15]。VEGF被认为是最重要的血管生成促进因子[16]。有研究显示，血清HGF与VEGF-A的表达呈正相关，HGF可能通过促进结直肠癌细胞VEGF-A的表达，进而共同促进血管新生，导致肿瘤血管聚集，从而发生肿瘤转移。研究证实血清HGF水平随着大肠癌的病情进展而逐渐增高[17]。李美琴等[18]研究表明HGF的表达与大肠癌瘤体大小、浸润深度、TNM分期、淋巴结转移及肝转移有关，大肠癌组织HGF的表达水平可以作为肝转移的预测指标。

“正气存内，邪不可干，邪之所凑，其气必虚”，历代医家认为疾病的发生与正邪两气密切相关，大肠癌亦如此，正气亏虚是其发病的内因。脾肾乃先后天之本，二者相互滋养，诸虚之中以脾肾亏虚尤甚[19]。在脾肾亏虚的基础上，加之饮食失节、感受六淫之邪或情志失调等，全身气机失畅，血流瘀滞，瘀毒内生，结滞成块，聚于肠腑而为病[20-21]。华佗所著《中藏经》有言：“夫痈疽疮肿之所作也，皆五脏六腑蓄毒不流则生矣，非独因荣卫壅塞而发者也。”说明肿瘤的发生除与机体正气不足有关外，亦与脏腑蓄毒密切相关。故治疗可以健脾补肾、化瘀解毒为法[22]。抗癌防移片系三湘名医经验方，由红参、半枝莲、黄芪、薏苡仁、姜黄、女贞子、墨旱莲、莪术、九香虫、枸杞子、白术、湘曲组成，以健脾补肾、化瘀解毒为法。临床研究显示，抗癌防移片可降低大肠癌患者术后复发转移率。

本研究结果显示，抗癌防移片高剂量对小鼠精神状态、大便稀溏等一般情况明显改善，可在一定程度改善大肠癌肝转移小鼠体重下降，抑制小鼠大肠癌肝转移瘤的生长，抑制大肠癌肝转移小鼠血清肿瘤标记物CA199、CEA表达水平。大肠癌肝转移与血管新生关系密切，HGF、VEGF-A可正向调节细胞有丝分裂、血管内皮细胞增殖、血管生成等[23]。与模型组比较，抗癌防移片高剂量组小鼠血清HGF、VEGF-A表达下调，且呈剂量依赖性，提示抗癌防移片可能通过抑制HGF、VEGF-A表达发挥抗大肠癌肝转移的作用。在光镜下观察大肠及肝脏病理组织变化提示，与模型组比较，抗癌防移片高剂量组小鼠大肠及肝脏未见明显的肿瘤细胞，细胞形态较为规整。

综上所述，抗癌防移片对预防大肠癌肝转移有一定作用，其机制可能与抑制HGF、VEGF-A蛋白表达有关。