紫杉醇促进心肌细胞微管结构稳定上调HO-1表达预防再灌注损伤的机制研究

周 乐，徐佩尔，郑玉婷，陆瑾玥，顾佳妮，胡 牵，宫悦华，颜雪芸，曹华明

(1.上海市静安区市北医院心内科，上海200435;2.上海中医药大学教育基地,上海201203)

据2019年世界卫生组织的调查，缺血性心脏病是全球第一主要死因。心肌缺血组织的及时再灌注是治疗干预的关键步骤。然而，突然再灌注可导致进一步的心肌损伤，称为心肌缺血/再灌注(Myocardial ischemia/reperfusion，MI/R)损伤[1-3]。MI/R的发病机制非常复杂，包括细胞内钙过载、氧化应激、线粒体损伤、内质网功能损伤、细胞凋亡和自噬、炎症等[4]。在MI/R损伤后的心脏功能障碍期间，氧化应激会产生有害影响。氧化应激是高活性分子如活性氧(Reactive oxygen species，ROS)、活性氮、超氧阴离子、羟基自由基和过氧亚硝酸盐的过度积累或去除不足导致的[5-6]。在心脏正常生理条件下，98%耗氧用于产生三磷酸腺苷(Adenosine triphosphate，ATP)，缺氧情况下，心肌能量代谢发生紊乱，ATP生成不足并迅速耗竭，并产生大量ROS。ROS的过度产生和积累不仅会引起线粒体膜氧化损伤，还会诱导微管等细胞骨架的破坏。心肌细胞中的微管可以通过某些阴离子通道控制线粒体外模对代谢物的通透性，调节细胞能量代谢[7]。微管若损伤，不能对心肌细胞起到支撑定型作用，会对DNA、蛋白质和脂质造成极大的损伤，降低心肌细胞稳定性，增加细胞脆性。导致心肌细胞功能障碍、细胞凋亡等[8]。因此，抑制氧化应激可能对预防MI/R具有重要意义。

有研究[9-10]表明，紫杉醇(Paclitaxel,PTX)能够作为微管稳定剂，能够抑制微管解聚，减轻心肌细胞缺血再灌注损伤。而血红素加氧酶(Heme oxygenase，HO)是血红素降解的限速酶，HO通过对催化血红素环裂解形成亚铁、一氧化碳和胆绿素的过程进行限速来保护细胞，防止MI/R损伤。HO有三种异构体，其中HO-1 受到多种生理和病理生理刺激的强烈诱导，包括血红素、炎性细胞因子和一氧化氮等。Lee等[11]的研究证实，HO-1的调控与丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinases，MAPK)通路密切相关，包括细胞外信号调节激酶(Extracellular regulated protein kinases，ERK)和氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)和 p38 MAPK 途径。而MAPK在细胞过程中影响细胞的增殖、应激以及细胞凋亡和免疫防御[12]。因此本次研究旨在探讨促进心肌细胞微管结构稳定上调HO-1表达是否能够预防心肌的再灌注损伤。

1 材料与方法

1.1 实验动物 60只6周龄雄性SD大鼠，体重230～300 g，购自北京维通利华实验技术有限公司[生产使用合格证号：SCXK(京)2018-0013]。使用标准笼和常规饲料进行喂养，喂养期间实验用鼠自由饮水进食。

1.2 心肌缺血再灌注模型的构建 大鼠腹腔注射0.2 ml/100 g戊巴比妥钠麻醉后，迅速从大鼠体内分理出心脏置入0 ℃ K-H缓冲液中漂洗停跳。然后将心脏快速固定于 Langendorff灌流装置，进行主动脉常氧恒流灌流。灌流液采用95% O2和5% CO2鼓泡式氧合的K-H缓冲液，灌注压维持75 mmHg，pH=7.35～7.45，37 ℃持续20 min。平衡灌注后观察心脏搏动情况[13]，对于符合《离体心脏缺血再灌时间与损伤模型的合理评价》[14]入选标准的大鼠进行后续研究。对于心肌缺血再灌注大鼠进行前降支结扎左侧冠状动脉30 min诱导缺血。若冠脉流量降低25%则说明结扎成功阻断血流[15]。

1.3 分组和干预 30只大鼠被随机均分为对照组、缺血组和PTX组，每组共10只大鼠。对照组：20 min平衡期后，接受常氧灌注120 min；缺血组：20 min平衡期后，进行30 min缺血前降支结扎，随后接受常氧灌注120 min；PTX组：20 min平衡期后，进行30 min缺血前降支结扎，随后加入就含有1 μmol/L的PTX常氧灌注液灌注120 min。

1.4 检测方法

1.4.1 微管损伤检测：灌流结束时用高碘酸赖氨酸多聚甲醛固定剂灌注心肌组织，然后剪下左心室肌在PBS中清洗，制成冰冻切片并进行微管和肌丝蛋白双染色。加入1∶300 稀释的单克隆抗体-β微管蛋白抗体及1∶300 稀释的荧光异硫氰酸酯标记的山羊抗鼠免疫球蛋白进行温育。其他切片在室温下用1∶70稀释的鬼笔环肽温育20 min，然后用PBS冲洗。在荧光显微镜下检测。

1.4.2 信号通路的药理学抑制实验：为了研究PTX治疗有效的相关分子机制，另选30只大鼠随机分为三组：缺血组2组、PTX2组 (1 μmol/L) 和秋水仙碱组(1 μmol/L)，每组10只。用戊巴比妥钠(100 mg/kg)麻醉动物。同1.2方式进行造模。将三组大鼠灌流液中分别加入1 μmol/L的JNK抑制剂JNK-IN-8、10 μmol/L的 p38 MAPK抑制剂Adezmapimod、10 μmol/L的MEK1抑制剂AZD6244。再灌注结束后，迅速分离心肌组织，收集心肌细胞在室温下被储存在含1 μmol/L氯化钙的台氏液中。温育后，用PBS冲洗，然后用含有蛋白酶抑制剂Cocktail的RIPA裂解缓冲液进行裂解。用BCA蛋白定量分析试剂盒对蛋白进行分析，等量的总细胞裂解物通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离，然后转移到聚乙烯膜PVDF上。室温下封入BSA封闭液(5% PBS缓冲液+0.1%吐温20)1 h。加入初级抗体，在室温下按1∶1000～1∶2000 的体积比，将适当次级抗体加入PBS+0.1%吐温20中1 h，用通过ECL试剂盒探测信号。

2 结 果

2.1 PTX降低微管缺血损伤 通过免疫组织化学分析微管形态(图1)。在对照组中可见微管结构完整，无明显断裂；在缺血组中可见微管连续中断，微管断裂；在PTX组中可见微管结构基本完整，但微管稍有粗乱。表明PTX能够降低微管缺血损伤。

图1 对照组、缺血组和PTX组的微管形态结构(免疫荧光，×400)

2.2 PTX能够诱导微管蛋白表达并可能通过激活JNK途径诱导心脏心肌细胞中HO-1基因表达 蛋白质印迹分析缺血2组、PTX2组以及秋水仙碱组大鼠心肌细胞中微管蛋白和HO-1 相关基因的表达(图2)。PTX2组微管蛋白的表达水平明显高于的缺血2组和秋水仙碱组，秋水仙碱处理过的微管蛋白的表达水平最少。通过密度分析来量化蛋白表达水平和磷酸化水平在三种MAPK(ERK、JNK、p38)中的活性，只有JNK磷酸化水平在PTX组中被显著诱导，在秋水仙碱组中降低。这表明PTX可能借助JNK1信号诱导增加HO-1表达而保护心脏心肌细胞抵御MI/R损伤。

注:与缺血2组比较，*P<0.05

2.3 PTX激活JNK诱导HO-1表达 见图3。

注:与PTX-Adezmapimod组比较，*P<0.05

AZD6244、Adezmapimod和JNK-IN-8 三种MAPK抑制剂分别用来研究被PTX激活的JNK是否调节HO-1表达。发现AZD6244和Adezmapimod没有改变PTX诱导HO-1表达。相比之下，JNK-IN-8显著抑制PTX诱导的HO-1表达。表明PTX通过激活JNK来诱导HO-1表达。

3 讨 论

缺血缺氧会引起细胞离子通道改变、钙超载，破坏细胞形态结构，导致骨架蛋白损伤或缺失，在缺氧或缺血期间，细胞骨架的紊乱引起细胞结构完整性改变。研究[12-13]发现，在细胞重建过程中，细胞骨架蛋白、代谢酶、氧化应激相关蛋白和离子通道蛋白的表达上调。 Wei等[16]研究证明增加热休克蛋白的表达，能够与肌动蛋白相结合并稳定肌动蛋白的细胞骨架，从而心肌增强细胞对MI/R的抵抗力[17-18]。

p38MAPK、ERK1/2和JNK三种激酶是丝裂原活化蛋白激酶重要组成部分，MAPK信号转导途径在介导细胞反应时有着十分重要的作用，其广泛存在于细胞的生长繁殖、分裂死亡以及细胞内各种生化反应信号的变化过程中，参与调节细胞的增殖、迁移和死亡等生物过程[19]。研究[20]发现，JNK和p38MAPK的激活会促使细胞凋亡，而ERK1/2的激活会抑制细胞凋亡。在本研究中，我们发现在心脏心肌细胞中PTX能激活被证实能诱导细胞死亡的JNK，介导HO-1表达。JNK-IN-8(JNK特异性抑制剂)，能显著抑制PTX诱导的HO-1表达。

我们发现作为微管稳定剂能有效地减少MI/R损伤时的ROS水平，这与以前的研究结果一致。线粒体复合物Ⅰ和Ⅲ是产生细胞ROS的主要来源，在本研究中，我们发现PTX能显著保护缺血时这两种酶活性。此外，既往研究中，发现HO-1能显著增加大脑对缺血性氧化应激的抵抗[21]，HO-1的过表达也显示出对MI/R损伤的保护作用。本研究中，我们对缺血时PTX是否诱导HO-1进行了研究，结果证实缺血时PTX能诱导HO-1表达。JNK-IN-8，一种JNK特异性抑制剂，能显著抑制PTX诱导的HO-1表达，这或许是PTX在MI/R损伤期间能保护但不能杀死心脏心肌细胞的原因之一。

在MI/R中，细胞骨架损害会导致细胞破裂和诱发凋亡，因此从保护细胞骨架稳定或加强受损细胞骨架及其相关蛋白的修复来进行心脏保护，可能是今后治疗缺血型心脏病的有效靶点及研究方向。对进一步探讨心肌缺血的机制研究具有重要意义。