针灸对帕金森病小鼠黑质白细胞介素-17受体A/核因子κB信号通路的影响

高 崚 陈王璐 陈奕奕 张潇文 王照钦, 刘慧荣,

(1 河南中医药大学，郑州，450046；2 河南中医药大学针灸推拿学院，郑州，450003；3 上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院，上海，200437；4 上海市针灸经络研究所，上海，200030)

帕金森病(Parkinson′s Disease，PD)是一种起病隐匿、病情呈进展性加重的神经退行性疾病，其病理主要是黑质致密区多巴胺(Dopamine，DA)神经元变性坏死伴胞质内嗜酸性包涵体-路易小体(Lewy Body，LB)的形成[1]。LB的主要成分是α-突触核蛋白(α-synuclein，α-syn)。研究表明病理性α-syn具有神经毒性，异常聚集于内质网会损伤其正常生理功能，引起内质网应激，导致多巴胺能神经元进行性坏死，进而神经元内多巴胺合成限速酶——酪氨酸羟化酶(Tyrosine Hydroxylase，TH)水平下降，引起各种临床症状[2-6]。

本团队前期研究发现，针灸可以改善PD患者临床症状，并对1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine,MPTP)诱导的PD模型小鼠肠道菌群具有显著的调节作用[7-8]。白细胞介素-17(Interleukin-17，IL-17)是促炎症介质，研究表明，PD患者脑内生产IL-17的T淋巴细胞(Th17细胞)和IL-17在PD相关的神经元死亡中有重要作用，IL-17受体及下游的核因子κB通路激活是神经元死亡的主要原因，且IL-17受体在PD患者脑黑质致密部(Substantia Nigra Pars Compacta，SNpc)神经元中上调可能是该通路具有较高活性的重要因素[9]。因此本研究采用行为学检测方法、免疫组织化学法、蛋白质免疫印迹法，探讨针灸对MPTP诱导的PD模型小鼠运动迟缓的作用，并探索其对PD小鼠黑质IL-17受体A/核因子κB信号通路中相关因子活性的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 健康无特定病原体(Specific Pathogen Free,SPF)级8周龄雄性C57BL/6小鼠50只，购自上海吉辉实验动物饲养有限公司，许可证号：SCXK(沪)2017-0012。饲养于上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院实验动物中心屏障环境内(伦理审批号：YYLAC-2019-060-2)。在室温22～25 ℃，光周期为12 h光照及12 h黑暗条件下饲养，适应性喂养1周。实验过程严格按照中华人民共和国科技部发布的《关于善待实验动物的指导性意见》。

1.1.2 主要试剂与仪器 MPTP(Sigma公司，美国，批号：M0896)，甲磺酸雷沙吉兰(Sigma公司，美国，批号：SML0124)，氯仿(上海苏懿化学试剂有限公司，批号：151823)，异丙醇(国药集团化学试剂有限公司，批号：A451-4)，无水乙醇(国药集团化学试剂有限公司，批号：111727)，mRNA抽提Trizol(Invitrogen公司，批号：15596018)。疲劳转棒仪(成都泰盟软件有限公司，型号：ZB-200)，Gilson移液器(Gilson Inc.公司，法国，型号：F144055P)，高速冷冻离心机(Eppendorf公司，德国，型号：5424R)，超细电动匀浆机(Fluko公司，德国，型号：F6/10-6G)，WB Bio-Rad电泳仪(伯乐公司，型号：1658001)，WB电泳转膜仪(大连竞迈科技有限公司，型号：PS-9)，凝胶成像系统(伯乐公司，美国，型号：ChemiDoc XRS+)，定时水平摇床(Crystal公司，美国，型号：OS-03U)。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备 将实验小鼠随机分为空白组、模型组、针刺组、针刺艾灸组、雷沙吉兰组，每组10只。每天称重小鼠体质量并记录，于同一时间以MPTP腹腔注射给药进行造模，腹腔注射的部位选择在腹膜区略向上，以避免略向右上穿刺小肠和膀胱，将35.1 mg MPTP·HCl溶解于10 mL 0.9%氯化钠溶液中，以10 μL/(g·d)的剂量，空白组注射等剂量的0.9%氯化钠溶液，1次/d，连续注射5 d。

1.2.2 给药方法 1)针刺组：模型制备成功后，次日起每日将小鼠固定在特制鼠架上，采用0.25 mm×13 mm规格一次性无菌针灸针(苏州华佗)，取百会、阳陵泉进行针刺，捻转15 s后每间隔5 min捻转15 s，共留针15 min，干预1次/d，共干预14 d。穴位定位参照《针灸实验学》和《实验动物针灸手册》中“常用实验动物针灸穴位”的规定，并结合动物比较学方法，根据比较解剖学进行取穴[10]。

2)针刺艾灸组：模型制备成功后，固定及针刺选穴、干预方法同针刺组，针刺干预结束后将小鼠腹部皮毛剃净，以0.5 cm×12 cm规格特制细艾条温和灸关元穴，使穴位局部皮肤温度达到45 ℃左右，持续15 min，干预1次/d，共干预14 d。3)雷沙吉兰组：模型制备成功后，次日起每日以甲磺酸雷沙吉兰0.2 mg/kg的剂量进行灌胃，并记录体质量，1次/d，共灌胃14 d。空白组、模型组与针刺组、针刺艾灸组、雷沙吉兰组进行相同的抓取和固定，不做其他干预。

1.2.3 检测指标与方法 疲劳转棒实验评分：采用疲劳转棒仪进行评估[11]。将小鼠放置于直径约3 cm的转棒上(小鼠的头朝向转棒仪内，于两侧挡板之间)。5 min内，旋转速度从10 r/min逐渐增加至30 r/min，在MPTP注射前训练3 d，使之能够在20 r/min的转棒上维持120 s，在干预结束后当天，转棒测试10、15、20、25、30 r/min下保持时间，并采用梯形法计算总体转棒评分(Overall Rotarod Performance，ORP)。

荧光染色技术检测黑质区TH、α-syn的表达：4%多聚甲醛固定、切片，室温封闭60 min后，分别滴加浓度为1∶1 000的TH和α-syn一抗，于4 ℃湿盒中孵育过夜(15 h)，滴加二抗，室温孵育1～2 h，滴加新鲜配制的DAB显色液，于显微镜下观察，阳性表达为棕黄色或棕褐色。蛋白质免疫印迹法检测黑质致密部IL-17受体A、核因子κB、p-核因子κB抑制剂(Inhibitor of Kappa B Alph,IκBα)、IκBα、p-转化生长因子活化激酶1(Transforming Growth Factor-activated Kinase 1,p-TAK1)、TAK1、激活蛋白1(Activator 1,Act1)表达：黑质组织剪碎加裂解液匀浆离心提取总蛋白(离心半径10 cm)，SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳至溴酚蓝刚跑出，电转移至聚偏二氟乙烯(Polyvinylidenefluoride，PVDF)膜上，加抗体孵育并显色，用Scion Image图像分析系统对蛋白条带进行分析，蛋白质的相对含量以目的蛋白与β-actin条带光密度的比值表示。

2 结果

2.1 疲劳转棒仪评分 雷沙吉兰组小鼠ORP与模型组比较，差异无统计学意义(P>0.05)；针刺艾灸组小鼠及针刺组小鼠ORP均高于模型组，2组比较差异均有统计学意义(均P<0.05)；雷沙吉兰组与针刺组、针刺艾灸组比较，差异均有统计学意义(均P<0.05)；针刺艾灸组与针刺组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 各组小鼠ORP比较分，n=8)

2.2 荧光染色技术检测黑质区酪氨酸羟化酶的表达 空白组与其他组比较，TH表达更强，数量多且密度大，分布范围广，呈明亮的荧光绿色；模型组与空白组比较，TH数量明显减少，分布范围缩小，免疫荧光染色表达弱，TH成暗淡的荧光绿色；针刺组、针刺艾灸组、雷沙吉兰组与模型组比较，TH免疫荧光染色表达增强，数量有所增加，分布范围扩大；针刺组、针刺艾灸组与雷沙吉兰组比较，TH免疫荧光染色表达增强，数量较多，荧光绿色信号较强；针刺艾灸组与针刺组比较，TH免疫荧光染色表达增强，数量较多，分布较广，荧光绿色更明亮，更加接近空白组。与空白组比较，模型组小鼠TH黑质表达量明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，针刺组、针刺艾灸组与雷沙吉兰组的表达量均增加，差异有统计学意义(P<0.05)；其中针刺艾灸组增加最明显。见图1、表2。

表2 各组小鼠黑质区TH表达量比较

图1 各组小鼠黑质区TH蛋白表达(免疫荧光染色,×400)

2.3 荧光染色技术检测α-syn的表达 模型组与其他组比较，α-syn免疫荧光染色表达更强，数目多，分布范围广，呈明亮的荧光绿色；空白组与模型组比较α-syn数量明显减少，分布范围减小，免疫荧光染色表达呈暗淡的荧光绿色；针刺组、针刺艾灸组、雷沙吉兰组与模型组比较，α-syn免疫荧光染色表达减弱，细胞数量有所减少，分布范围变小；针刺组、针刺艾灸组与雷沙吉兰组比较，α-syn免疫荧光染色表达减弱，细胞较少，荧光绿色信号较强；针刺艾灸组与针刺组比较，α-syn免疫荧光染色表达减弱，细胞较少，分布较少，荧光绿色更暗，更加接近空白组。与空白组比较，模型组小鼠黑质α-syn免疫荧光强度明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，雷沙吉兰组小鼠黑质α-syn荧光强度降低，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，针刺组与针刺艾灸组α-syn免疫荧光强度明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见图2、表3。

表3 各组小鼠黑质区α-syn表达比较

图2 各组小鼠黑质区α-syn蛋白表达(免疫荧光染色，×400)

2.4 各组小鼠黑质致密部IL-17受体A蛋白相对表达量 与空白组比较，模型组IL-17受体A蛋白表达上升，但差异无统计学意义(P>0.05)；与模型组比较，针刺艾灸组IL-17受体A蛋白表达降低，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，雷沙吉兰组、针刺组IL-17受体A蛋白表达降低，差异无统计学意义(P>0.05)。见图3、表4。

表4 各组小鼠黑质致密部IL-17受体A蛋白相对表达量比较

图3 各组小鼠黑质致密部IL-17RA蛋白表达电泳图

2.5 各组小鼠黑质致密部Act1相对表达量 与空白组比较，模型组小鼠黑质致密部Act1表达下降，差异无统计学意义(P>0.05)；与模型组比较，雷沙吉兰组、针刺组、针刺艾灸组小鼠黑质致密部Act1表达差异无统计学意义(P>0.05)。见图4、表5。

图4 各组小鼠黑质致密部Act1蛋白表达电泳图

表5 各组小鼠黑质致密部Act1相对表达量比较

2.6 各组小鼠黑质致密部p-TAK1蛋白相对表达量 与空白组比较，模型组小鼠黑质致密部p-TAK1蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)；与模型组比较，雷沙吉兰组、针刺组、针刺艾灸组小鼠黑质致密部p-TAK1蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)。见图5、表6。

图5 各组小鼠黑质致密部p-TAK1蛋白表达电泳图

表6 各组小鼠黑质致密部p-TAK1蛋白相对表达量比较

2.7 各组小鼠黑质致密部TAK1蛋白相对表达量 与空白组比较，模型组小鼠黑质致密部TAK1蛋白表达有升高趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)；与模型组比较，雷沙吉兰组、针刺组、针刺艾灸组小鼠黑质致密部TAK1蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)。见图6、表7。

图6 各组小鼠黑质致密部TAK1蛋白表达电泳图

表7 各组小鼠黑质致密部TAK1蛋白相对表达量比较

2.8 各组小鼠黑质致密部p-TAK1/TAK1蛋白相对表达量比率 与空白组比较，模型组小鼠黑质致密部p-TAK1/TAK1蛋白相对表达量比率差异无统计学意义(P>0.05)；与模型组比较，雷沙吉兰组、针刺组、针刺艾灸组小鼠黑质致密部p-TAK1/TAK1蛋白相对表达量比率差异无统计学意义(P>0.05)。见表8。

表8 各组小鼠黑质致密部p-TAK1/TAK1蛋白相对表达量比率比较

2.9 各组小鼠黑质致密部p-IκBα比较 与空白组比较，模型组小鼠黑质致密部p-IκBα表达明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，雷沙吉兰组、针刺组、针刺艾灸组小鼠黑质致密部p-IκBα表达均降低，差异均有统计学意义(均P<0.05)。见图7、表9。

图7 各组小鼠黑质致密部p-IκBα蛋白表达电泳图

表9 各组小鼠黑质致密部p-IκBα比较

2.10 各组小鼠黑质致密部IκBα相对表达量 与空白组比较，模型组小鼠黑质致密部IκBα表达下降，但差异无统计学意义(P>0.05)；与模型组比较，雷沙吉兰组、针刺组、针刺艾灸组小鼠黑质致密部IκBα表达差异均无统计学意义(均P>0.05)。见图8、表10。

图8 各组小鼠黑质致密部IκBα蛋白表达电泳图

表10 各组小鼠黑质致密部IκBα相对表达量比较

2.11 各组小鼠黑质致密部p-IκBα/IκBα比较 与空白组比较，模型组小鼠黑质致密部p-IκBα/IκBα升高，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，雷沙吉兰组、针刺组、针刺艾灸组小鼠黑质致密部p-IκBα/IκBα率降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见表11。

表11 各组小鼠小鼠黑质致密部p-IκBα/IκBα比较

2.12 各组小鼠核因子κB相对表达量 与空白组比较，模型组小鼠黑质致密部核因子κB蛋白表达明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，雷沙吉兰组、针刺组、针刺艾灸组小鼠黑质致密部核因子κB蛋白表达均降低，差异均有统计学意义(均P<0.05)。见图9、表12。

图9 各组小鼠黑质致密部核因子κB蛋白表达电泳图

表12 各组小鼠黑质致密部核因子κB蛋白相对表达量比较

3 讨论

帕金森病(PD)属“颤证”“震颤”“颤振”“掉”等范畴，症可见头身肢体不自主地摇动、颤抖为主要临床表现的一种病证[12-13]。为本虚标实之病，病位在筋脉，与肝、脾、肾等脏关系密切[14-16]。如《素问长刺节论》曰：“病在筋，筋挛节痛，不可以行，名曰筋痹。”本课题组认为该病的病因病机属于阴阳失衡，督脉失职，筋脉失养所致。《灵枢·邪气藏府病形篇》曰：“筋急，阳陵泉主之。”阳陵泉为“筋会”，有舒筋缓急的作用，为筋气聚会之外，故阳陵泉是治疗筋病的要穴，特别是下肢筋病，临床较为常用，具有舒筋和壮筋的作用[17]。百会穴与脑联系密切，作为督脉的重要穴位，亦是“三阳五会”之穴，其位于巅顶，是调节大脑功能的要穴，其穴性属阳，又于阳中寓阴，故能通达阴阳脉络，连贯周身经穴，对于调节机体的阴阳平衡起着重要的作用[18]。故本实验选用百会联合阳陵泉，通过强筋补髓，调和阴阳缓解PD小鼠症状。

核因子κB是一种多向性炎症转录因子，在调控免疫细胞的激活、T淋巴细胞的发育、细胞凋亡、肿瘤形成、病毒复制、炎症反应及多种自身免疫性疾病等方面发挥重要作用[19]。核因子κB转录、活化与炎症反应有关的靶基因，其表达产物主要参与免疫应答和炎症反应，最终导致细胞损害[20]。研究表明，IL-17RA/核因子κB通路激活是PD神经元死亡的主要原因之一。在与PD患者的T淋巴细胞共培养或添加IL-17情况下，通过诱导多能干细胞(Induced Pluripotent Stem Cells，iPSC)衍生的PD中脑神经元(Midbrain Neuron，MBN)上调IL-17受体信号转导和其下游靶标，激活B细胞核因子κ轻链增强剂(核因子κB)而导致MBN死亡，添加IL-17、IL-17受体的阻断剂或添加IL-17抗体苏金单抗(Secukinumab)则可挽救此种死亡。另一方面，PD患者人诱导多能干细胞来源的MBN中IL-17受体表达显著上升，可能是此类MBN对IL-17和PD来源的T淋巴细胞的特异性反应的基础，“迎接”更多的IL-17而激活核因子κB通路[9]。本研究发现，MPTP诱导的PD模型小鼠核因子κB表达明显升高，而TH表达显著降低，证实了核因子κB的活化是促进多巴胺能神经元死亡的重要机制。PD模型小鼠IL-17受体A蛋白表达表现出一定的上升，而针刺艾灸干预可以显著抑制IL-17受体A表达，且雷沙吉兰组、针刺组、针刺艾灸组与模型组比较，核因子κB表达均降低，提示调节IL-17/NF-κB通路可能是针灸保护黑质多巴胺能神经元的一个关键环节。

核因子κB ACT1是IL-17受体A下游至核因子κB信号通路所必需的衔接蛋白，介导从IL-17受体A到核因子κB和其他转录因子信号通路的活化。而肿瘤坏死因子相关因子6是ACT1的关键底物，在核因子κB激酶抑制物(Inhibitor of Nuclear Factor Kappa-B Kinase,IKK)相关激酶与ACT1的相互作用下，参与到IL-17介导的ACT1的磷酸化过程，促使核因子KB的激活[21]。在本研究中，各组之间的ACT1表达差异无统计学意义(P>0.05)，ACT1在模型组核因子κB激活环路中的角色尚不明确，另一方面，IKK相关激酶(TANK-结合激酶1和诱导核因子κB激酶抑制物)对ACT1的磷酸化修饰是IL-17通路负反馈调控的关键机制，ACT1的磷酸化水平有待进一步的研究探明。核因子κB在PD的发病过程中的激活，TAKl通过多种形式参与。模型组与空白组比较，p-TAK1、TAK1的表达以及p-TAK1/TAK1比值差异均无统计学意义(均P>0.05)，提示TAK1及其磷酸化水平在PD中脑核因子κB相关通路中的角色尚不明确，有待进一步研究。

IκBα结合形成异源二聚体存在于细胞质中，在外界多种因素刺激下，IκBα可磷酸化并迅速降解使核因子κB得以释放，与靶基因启动因子结合介导多种炎症介质包括诱生型一氧化氮合酶的过量表达[22]。本研究观察到，各组间IκBα蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)，而模型组与空白组比较，p-IκBα表达及p-IκBα/IκBα的比值显著升高，提示模型组中脑黑质存在核因子κB的显著活化，而雷沙吉兰组、针刺组、针刺艾灸组与模型组比较，p-IκBα表达与p-IκBα/IκBα比值均降低，表明3种方法均可有效降低IκBα的磷酸化水平，抑制核因子κB活化，提示抑制IκBα的磷酸化可能是针灸调节IL-17受体通路的关键作用机制之一。

综上所述，本研究发现MPTP诱导的PD模型小鼠中脑黑质部IL-17受体A/NF-κB信号通路异常，并发现针灸可以调节IL-17受体A/NF-κB信号通路活性，调控IκBα的磷酸化水平可能是其中的关键机制之一。