定坤丹对宫腔粘连大鼠血管生成及PI3K/AKT/mTOR通路的影响研究

刘超萍 李 姣

(湖南中医药大学第一附属医院妇产科，长沙，410007)

宫颈粘连(Intrauterine Adhesion，IUA)多由刮宫术后子宫内膜损伤引起，以子宫内膜粘连、子宫腔部分或完全闭塞、下腹部周期性疼痛、月经减少、不孕等为主要表现，为妇产科常见疾病之一[1]。研究表明，约有40%的不孕病例和7%的继发性闭经病例与IUA相关[2]。目前对其发病机制的认识主要包括子宫内膜干细胞损伤、局部神经痉挛、纤维细胞增殖及新生血管形成等。近几年研究发现，磷脂酰肌醇3激酶(Phosphoinositide 3-kinase，PI3K)/蛋白激酶B(Protein Kinase B,AKT)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(Mammalian Target of Rapamycin，mTOR)信号通路能够参与子宫内膜血管新生过程，与IUA的发生发展关系密切，通过干预PI3K/AKT/mTOR通路能够有效抑制IUA大鼠子宫内膜的增生[3-4]。定坤丹为治疗经血不调的名方，具有补肾养血，调经止痛之功效。临床研究证明，其用于IUA患者具有良好疗效，能够显著改善患者症状，减轻子宫腔粘连及子宫内膜增生，然而其发挥作用的具体机制尚未明晰[5]。本研究通过机械刮宫结合脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)感染建立IUA大鼠模型，观察不同剂量定坤丹治疗大鼠IUA的效果，并探讨其调节PI3K/AKT/mTOR信号通路抑制IUA内膜血管生成及炎症反应，恢复子宫形态的潜在机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 无特定病原体(Specific Pathogen Free,SPF)级SD大鼠60只，雌性，体质量180～200 g，由湖南省实验动物中心提供，动物合格证号：SYXK(湘)2020-0015。于我院SPF级实验动物房中饲养，室内保持20～22 ℃，明暗交替各12 h。所有动物实验均经我院实验动物福利伦理委员会审核批准(伦理审批号：20210412)。

1.1.2 药物 脂多糖(Sigma公司，美国，货号：L2880)；定坤丹(山西广誉国药有限公司，批号：20210308)；戊酸雌二醇片(拜耳医药保健有限公司，批号：108492)。

1.1.3 试剂与仪器 大鼠血管内皮生长因子(Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF)、白细胞介素-6(Interleukin,IL-6)、白细胞介素-10(Interleukin-10，IL-10)酶联免疫吸附试验试剂盒(上海朗顿生物科技有限公司，批号：20210521、20210614、20210523)；VEGF抗体试剂盒(武汉博士德公司，批号：MK1165)；PI3K、AKT、mTOR一抗(Abcam公司，美国，批号：ab83091，ab35200，ab88204)；逆转录PCR(Reverse Transcription PCR，RT-PCR)引物(上海生工生物工程有限公司，货号：S0214)。组织切片机(Leica公司，德国，型号：RM 2135)；光学倒置显微镜(OLYMPUS公司，日本，型号：BX51)；低温高速离心机(Sigma公司，美国，型号：2K15)；多功能酶标仪(Tecan公司，瑞士，型号：GENIOSPLOS)；电泳仪(Bio-Rad公司，美国，型号：Mini-protean)，RT-PCR仪(Eppenndorf Centrifuge公司，德国，型号：7500)。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备 称取SD大鼠体质量并按体质量进行分层，随后取各层内大鼠，随机方法分为6组：空白组、模型组、戊酸雌二醇组、定坤丹低剂量组、定坤丹中剂量组、定坤丹高剂量组，每组10只。除空白组外，其余各组采用机械刮宫+LPS感染双重损伤法建立IUA模型[6]：大鼠给予腹腔注射水合氯醛(400 mg/kg)麻醉后，无菌条件下切开下腹，暴露子宫，于子宫上方约1/3处作3 mm纵切口，采用宫腔刮勺经切口沿大鼠宫腔全层行刮宫术，至宫腔肌壁出现粗糙感时停止搔刮；将无菌手术线提前置于6 mg/L的LPS生理盐水中，4 ℃浸泡24 h备用，于刮宫损伤后，将LPS手术线放入损伤宫腔，在腹壁留置约0.5 cm的尾丝以便随后取出，生理盐水冲洗并缝合切口，48 h后开腹，轻拉尾丝取出LPS棉线，生理盐水冲洗并关腹，9 d后肉眼可见大鼠子宫色苍白，宫腔狭窄，子宫四壁厚薄不均，病理可见宫腔狭窄，内膜粘连，腺体减少，组织纤维化增生，子宫内膜组织纤维化面积比明显增加，即为IUA造模成功[7]。

1.2.2 给药方法 各给药组于造模术后第1天开始灌胃给药治疗，戊酸雌二醇组予以0.3 mg/kg灌胃干预，定坤丹低剂量组、中剂量组、高剂量组根据临床人用剂量折算出大鼠等效剂量的1、2和4倍分别给予定坤丹混悬液(2.13、4.26、8.52 g/kg)灌胃治疗，1次/d，持续给药28 d。空白组、模型组给予等体积生理盐水灌胃处理。

1.2.3 检测指标与方法

1.2.3.1 苏木精-伊红(Hematoxylin Eosin，HE)染色观察子宫组织病理形态 各组大鼠腹主动脉取血后处死，解剖后取部分子宫组织，置于10%多聚甲醛溶液中固定48 h，依次放入梯度乙醇中浸泡脱水，置于透明剂二甲苯中透明，经石蜡液包埋后冷却凝固，切片机作5 μm厚切片。切片于恒温箱中烘干，采用二甲苯脱蜡、梯度乙醇水化、苏木精染色、1%盐酸乙醇分化、伊红染色、梯度乙醇脱水、二甲苯透明后，用中性树胶封片，倒置光学显微镜下观察子宫组织形态并拍照。

1.2.3.2 Masson染色观察子宫组织纤维化面积 大鼠经腹主动脉取血后处死，解剖后取部分子宫组织，置于10%多聚甲醛溶液中固定48 h，依次放入梯度乙醇中浸泡脱水，置于透明剂二甲苯中透明，经石蜡液包埋后冷却凝固，切片机作5 μm厚切片，行Masson染色，于高倍镜(×200)下选取6个视野，采用Image-Pro Plus软件计算组织纤维化面积比，纤维化面积比=纤维化面积/视野总面×100%[8]。

1.2.3.3 酶联免疫吸附试验检测血清中VEGF、IL-6、IL-8水平 大鼠经腹主动脉取血，血液于离心半径13.5 cm，3 000 r/min转速下离心15 min以分离血清，将血清样品分装并冻存于-20 ℃冰箱备用。临用前将血清置于常温下平衡1 h，3 000 r/min(离心半径13.5 cm)，离心15 min，样品孔加入血清样品10 μL，样品稀释液40 μL和辣根过氧化物酶标记的抗体100 μL，同时做空白孔和标准孔，37 ℃恒温箱中孵育1 h，洗板6次，各孔加入显色液100 μL，37 ℃恒温箱避光孵育15 min，加入终止液50 μL，酶标仪450 nm波长下检测各孔OD值，根据标准孔OD值绘制标准曲线，代入样品孔OD值计算各样本VEGF、IL-6、IL-8的表达水平。

1.2.3.4 免疫组织化学法检测子宫内膜VEGF蛋白表达 取大鼠部分子宫组织置于10%多聚甲醛溶液中固定48 h，经梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡液包埋后作5 μm切片，经脱蜡、透明和脱水后，切片滴加30%过氧化氢(H2O2)孵育20 min，枸橼酸钠抗原热修复15 min，牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin，BSA)封闭20 min，一抗4 ℃孵育过夜，二抗37 ℃恒温箱孵育20 min，链霉抗生物素蛋白-生物素-过氧化物酶复合物法(Streptavidin-biotin-peroxidase Complex method，SABC法)37 ℃恒温箱孵育20 min，滴加二氨基联苯胺(Diaminobenzidine，DAB)显色，中性树胶封片，倒置光学显微镜下观察拍照，Image J软件分析平均光密度值(MOD值)。

1.2.6 蛋白质印迹法检测子宫组织PI3K/AKT/mTOR通路蛋白表达 取大鼠部分子宫组织，冰上快速匀浆后，加入放射免疫沉淀分析裂解缓冲液(Radio-Immunoprecipitation Assay Buffer,RIPA buffer)，4 ℃，12 000 r/min(离心半径8 cm)离心20 min提取总蛋白，取少量上清二喹啉甲酸(Bicinchoninic Acid，BCA)法测定蛋白浓度。将蛋白样品调至等浓度，加入10 μL样品，SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳浓缩胶电泳分离，冰上转膜，5%脱脂奶粉室温封闭2 h，加入一抗，4 ℃冰箱孵育过夜，加入二抗，室温孵育2 h，滴加增强型化学发光试剂(Enhanced Chemiluminescence,ECL)，凝胶成像系统曝光并拍照，用ImageJ软件分析条带灰度值，计算目的蛋白表达量。

1.2.7 反转录PCR检测子宫组织PI3K/AKT/mTOR通路mRNA表达 取大鼠部分子宫组织，用无菌剪将组织块剪成碎块，采用Trizol裂解液提取总RNA，紫外分光光度法测定总RNA浓度，再将RNA逆转录为cDNA，按PCR试剂盒进行扩增，反应条件为95 ℃变性10 s，退火60 ℃ 30 s，40个循环。结果以β-actin为内参，2-△△Ct法分析相对mRNA表达量。具体引物序列见表1。

表1 各基因引物序列

2 结果

2.1 各组大鼠子宫病理形态变化 光镜下可见空白组大鼠子宫结构清晰完整，子宫腔通畅，内膜厚度正常，腺体量多；模型组正常宫腔结构消失，子宫腔变小变窄，腺体数量减少；与模型组比较，定坤丹各剂量组大鼠子宫结构均有不同程度改善，随给药浓度的增加，大鼠腺体数量逐渐增多，子宫腔逐渐通畅。见图1。

图1 各组大鼠子宫组织病理形态变化(HE染色，×50)

2.2 各组大鼠子宫纤维化面积 Masson染色显示，与空白组比较，模型组大鼠子宫组织纤维化面积比明显升高(P<0.01)；定坤丹各剂量组治疗后，大鼠子宫内膜组织中纤维化面积比随给药浓度的增加逐渐降低(P<0.05，P<0.01)。见图2～3。

图2 各组大鼠子宫组织纤维化情况(Masson染色，×200)

2.3 各组大鼠血清VEGF、IL-6、IL-8表达水平 与空白组比较，模型组大鼠血清中VEGF、IL-6、IL-8水平均有显著升高(P<0.01)；戊酸雌二醇及定坤丹各剂量组血清VEGF、IL-6、IL-8的水平较模型组均明显降低(P<0.05，P<0.01)，且定坤丹低剂量、中剂量、高剂量组之间呈剂量依赖性，以高剂量组改善作用最明显。见表2。

表2 大鼠血清中VEGF、IL-6、IL-8的水平

图3 各组大鼠子宫组织纤维化情况比较

2.4 各组大鼠子宫内膜VEGF蛋白阳性表达 免疫组化可见VEGF的阳性表达位于胞质内，呈棕黄色，胞核呈蓝染。空白组大鼠子宫内膜仅见少量VEGF阳性表达，模型组VEGF阳性表达较空白组明显增多，呈强阳性(P<0.01)；与模型组比较，定坤丹各剂量组VEGF表达均有不同程度的减少(P<0.05，P<0.01)，以定坤丹高剂量组最为明显。见图4～5。

图4 各组大鼠子宫内膜中VEGF的阳性表达(IHC染色，×200)

2.5 各组大鼠子宫组织PI3K/AKT/mTOR通路的蛋白表达 与空白组比较，各组大鼠AKT、mTOR的蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)，模型组大鼠PI3K、p-AKT和p-mTOR的表达较空白组显著升高(P<0.01)；定坤丹各剂量组剂量依赖地降低了大鼠子宫组织PI3K、p-AKT、p-mTOR的表达(P<0.05，P<0.01)。见图6～7。

图5 各组大鼠子宫内膜中VEGF的阳性表达比较

图6 各组大鼠子宫内膜组织PI3K/AKT/mTOR通路的蛋白表达

图7 各组大鼠子宫内膜组织PI3K/AKT/mTOR通路的蛋白表达比较

2.6 各组大鼠子宫组织PI3K/AKT/mTOR通路的mRNA表达 与空白组比较，模型组大鼠子宫组织中PI3K、p-AKT、p-mTOR的mRNA表达显著升高(P<0.01)；经定坤丹不同剂量治疗后，大鼠PI3K、p-AKT和p-mTOR的mRNA表达水平较模型组明显降低(P<0.05，P<0.01)，且效果具有剂量依赖型。见表3。

表3 各组大鼠子宫内膜组织PI3K/AKT/mTOR通路mRNA表达

3 讨论

IUA是由刮宫术、子宫内膜感染、创伤等因素导致的以宫腔粘连闭塞为主要表现的常见并发症。近年来，随着人工流产率的不断升高，IUA患病率也逐年攀升，由此引起的月经紊乱、闭经、周期性下腹疼痛、反复流产等一系列内分泌及生殖问题严重影响着患者的生殖健康[1-2]。目前临床针对IUA的治疗手段主要包括应用雌激素制剂结合宫腔镜粘连松解术，以及术后放置宫内节育器等方法辅助宫腔隔离，这些疗法虽然对部分患者具有良好疗效，但复发率较高，中度和重度IUA患者术后复发率高达23%和62%，宫内节育器的放置也会阻碍子宫内膜再生，引起宫内感染和再次粘连等问题[9]。

中医学中并无“IUA”相应病名记载，根据其症状表现可将其囊括于“妇人腹痛”“闭经”“不孕”等范畴。认为其病属本虚标实，以金器所伤，胞脉受损，瘀血内停为其标，肾精耗伤，冲任亏损，血海不足为其本，肾虚兼血瘀为其病机关键，故治疗当以益精补肾，化瘀活血为原则。定坤丹为清代治疗经血不调的名方，有补肾养血调经之效。方中以人参、白术、茯苓、甘草“四君子”益气补脾，鹿茸、杜仲、肉桂、鹿角霜补肾温阳，干姜温经通脉，当归、熟地黄、阿胶、枸杞子滋肝补肾，白芍、川芎行气活血，五灵脂、三七、延胡索、鸡血藤、红花、牛膝化瘀活血，香附、柴胡、乌药、砂仁、黄芩疏肝调经，清热解郁，诸药合用，既滋补肾精、培补气血，又行气化滞，活血消瘀，使补血而不留滞，化瘀而不伤血，用于肾虚血瘀之IUA具有满意疗效。本实验中，IUA模型大鼠子宫组织坏死，腺体减少，组织纤维化增生，纤维化面积与空白组比较明显增加，符合IUA特征，经不同剂量定坤丹灌胃干预后，子宫内膜损伤程度及纤维化面积比均有不同程度改善，提示定坤丹对刮宫损伤和LPS感染所致的IUA具有明显疗效。

现代医学对IUA的病理机制尚未完全明晰，多数研究认为，子宫内膜创伤所引起的炎症及局部新生血管的形成在其发生与进展中起到重要作用[10-11]。VEGF能够与血管内皮特异性结合，加速内皮细胞增殖和血管新生[12]。在子宫内膜出现感染和损伤后，局部缺血和炎症环境可刺激VEGF的表达增多，引起新生血管形成和炎症介质的释放，进而促使内皮细胞增殖，导致子宫内膜增生和浸润[13-14]。IL-6是巨噬细胞释放的一种多功能炎症介质，可参与机体局部炎症反应的形成，IL-8是一种重要的炎症介质，也是促血管生成因子[15-16]。在IUA发病过程中，受损子宫内膜引起的炎症反应可引起IL-6和IL-8水平的升高，IL-6又可诱导VEGF的表达增多，增多的VEGF和IL-8可进一步引起内皮细胞增殖和黏附，使细胞外基质降解减少，大量堆积于子宫内膜，使之逐渐被结缔组织取代，最终形成子宫内膜纤维化，为IUA的发病提供条件[17]。本实验中，经定坤丹不同剂量灌胃治疗后，IUA大鼠血清中IL-6、IL-8和VEGF的水平均明显降低，免疫组织化学显示子宫组织中VEGF的阳性表达亦有显著减少，提示定坤丹可通过抑制IL-6和IL-8炎症介质的释放，降低VEGF的表达而抑制子宫内膜新生血管形成，延缓IUA的进展。

PI3K/AKT/mTOR信号通路是机体调节细胞增殖分化、凋亡、自噬与血管再生的重要途径，与IUA的发病关系密切[18]。子宫内膜在缺血缺氧状态下，VEGF表达的增多能够诱导PI3K活化，AKT发生磷酸化，加速内皮细胞增殖并抑制其凋亡，PI3K/AKT的激活又可促进IL-8、VEGF等血管生成相关分子表达的增加，刺激血管内皮细胞生成，进而形成新生血管[19-20]。研究显示，通过抑制PI3K/AKT通路激活能够有效抑制IUA大鼠子宫内膜再生[4]。过度活化的PI3K/AKT进一步激活下游的mTOR，使其发生磷酸化，磷酸化的mTOR可发挥其生物活性，促使VEGF过量表达和内膜细胞的大量增殖[21]。本研究蛋白质印迹法和反转录PCR检测结果可见，定坤丹能够显著抑制IUA大鼠PI3K、p-AKT和p-mTOR的蛋白及mRNA水平，说明定坤丹可能通过抑制PI3K/AKT/mTOR信号转导通路的激活，发挥对IUA相关血管生成的抑制作用。

综上所述，定坤丹能够显著减轻IUA大鼠子宫组织损伤和宫腔粘连，其中定坤丹高剂量组对各项指标的改善更为明显，其作用机制可能与抑制PI3K/AKT/mTOR通路的活化水平，从而降低局部血管再生因子和炎症介质的分泌相关。