白花蛇舌草抗炎机制的网络药理学分析及实验研究

李 曼 张露蓉,2 金顺琪 侯文跃 梁国强,2

(1 南京中医药大学附属苏州市中医医院中心实验室，苏州，215000；2 苏州市吴门医派研究院中药研究与开发部，苏州，215000)

白花蛇舌草别名蛇舌草、蛇舌癀，是茜草科耳草属植物白花蛇舌草HedyotisdiffusaWilld.的干燥全草，性寒味苦甘，寒性清热，苦味燥湿，用于治疗各种湿热病症，具有清热、利湿、解毒的功效[1-2]。其提取物分布较广泛，包括蒽醌类、萜类、甾醇类和水溶性酚酸类等，具有抗炎抑菌、抗肿瘤、增强机体免疫的作用[3-7]。近年来，对白花蛇舌草抗炎作用的研究多停留在动物整体水平或细胞水平，对其中发挥抗炎作用的主要化学成分及机制研究并不深入[8-9]。网络药理学是基于系统生物学理论，对生物系统进行网络分析，是研究中药“多成分-多靶点-多通路”的作用手段[10-12]。本研究利用网络药理学分析方法筛选白花蛇舌草中与抗炎相关的靶点通路，以动物实验模型评价其药效作用并检测血清中炎症介质含量，探讨其抗炎作用的物质基础及潜在的分子靶点，为白花蛇舌草抗炎机制研究提供参考。

1 资料与方法

1.1 相关活性成分的筛选及“成分-靶点”网络图的构建 通过中药系统药理学数据库与分析平台(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP，https://tcmspw.com/tcmspsearch.php)检索白花蛇舌草化学成分37个，以口服生物利用度(Oral Bioavailability，OB)≥30%、类药性(Drug Likeness，DL)≥0.18为条件筛选白花蛇舌草有效活性成分并匹配其相关靶点，将其靶点数据在UniProt数据库(https://www.uniprot.org/)中进行转化、确认，导入Cytoscape 3.7.2软件构建“白花蛇舌草活性成分-靶点”网络图。

1.2 疾病相关靶点的获取 以“Anti-Inflammatory”为检索词，在人类基因数据库(GeneCards)(https://www.genecards.org/)和在线人类孟德尔遗传数据库(Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM，https://omim.org/)数据库中搜索疾病靶点，根据Relevance Score值以中位数卡点获得相关疾病靶点，利用韦恩图在线绘制工具筛选白花蛇舌草抗炎成分和相关炎症靶点的交集基因并绘图。

1.3 蛋白质-蛋白质相互作用(Protein-protein Interaction，PPI)构建 将活性成分和疾病的交集靶点上传至STRING数据库(https://www.string-db.org/)，构建PPI网络，结果导入Cytoscape 3.7.2软件，计算各节点的Degree值，PPI图根据Degree值大小进行排列。

1.4 基因本体(Gene Ontology,GO)富集分析和京都基因和基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)富集分析 将共有靶点导入Metascape数据库(http://metascape.org/gp/index.html#/main/step1)进行GO和KEGG通路的富集分析，物种选择“H.sapiens”，并运用相关软件绘图。

1.5 分子对接 选取PPI网络图中Degree值排名较高的靶点与相关活性成分进行分子对接，在RCSB PDB数据库(http://www1.rcsb.org/)中下载相关靶点的3D结构“pdb”文件，在ZINC数据库(http://zinc15.docking.org/)中下载化合物小分子的3D结构“mol2”文件，利用AutoDock软件进行分子对接，最终结果以结合能来评价分子对接情况。

1.6 动物实验材料

1.6.1 动物 健康ICR雄性小鼠，无特定病原体(Specific Pathogen Free,SPF)级，体质量在20～22 g，购自昭衍(苏州)新药研究中心有限公司，动物生产许可证号：SCXK(苏)2018-0006。饲养于南京中医药大学附属苏州市中医医院吴门医派研究院中心实验室动物房内(伦理审批号：2018伦动批006)，在室温22～25 ℃、相对湿度40%～50%、12 h光照条件下适应性喂养5 d。实验过程严格按照中华人民共和国科技部发布的《关于善待实验动物的指导性意见》。

1.6.2 药液的制备 白花蛇舌草样品购自药材市场或经产地采收，由苏州中医医院药剂科进行鉴别。精密称取白花蛇舌草干品40 g，用800 mL 75%乙醇(纯水)提取2次，每次微沸后提取1 h，最后合并醇提液(水煎液)，旋蒸浓缩，冷冻干燥为粉末，冷藏备用。

1.6.3 试剂与仪器 95%乙醇(分析醇，上海联试化工试剂有限公司，批号：160702)，双氯芬酸钠缓释片(北京诺华制药有限公司，批号：x0804)；二甲苯(上海联试化工试剂有限公司，批号：20131201)；醋酸(天津市致远化学试剂有限公司，批号：201620910236)；酶联免疫吸附试验试剂盒(IL-6、TNF-α)(联科生物技术股份有限公司，货号:70-EK2062/2，70-EK2822/2)；玻璃旋转蒸发仪(Heidolph公司，德国，型号：Heizbad HB digit)；高速离心机(Sigma公司，德国，型号：1-13型)

1.7 实验方法

1.7.1 分组与给药 将小鼠随机分为模型组(0.9%生理盐水)、阳性药组(双氯芬酸钠缓释片，DSSRT，13 mg/kg)、白花蛇舌草水提物组[2、4、8 g(生药)/kg]、醇提物组[2、4、8 g(生药)/kg]，每组8只。实验前1 d禁食18 h。每天灌胃给药，1次/d，连续7 d。

1.7.2 二甲苯致小鼠耳肿胀实验 于末次给药1 h后，将20 μL二甲苯(100%)均匀涂抹于各组小鼠右耳的两面致炎，小鼠的左耳不涂作为对照，30 min后摘眼球取血并脱颈椎处死，沿小鼠耳郭剪下小鼠的两耳，用直径6 mm的打孔器在左右耳相同位置打下圆形耳片，分别称重，以双耳片的质量差作为耳肿胀度，计算肿胀抑制率。肿胀度=右耳质量-左耳质量。

将血液于离心机上3 500 r/min(离心半径6 cm)，离心10 min，取上清，按照酶联免疫吸附试验试剂盒说明书检测血清中白细胞介素-6(Interleukin-6，IL-6)、肿瘤坏死因子-α(Tumor Necrosis Factor，TNF-α)的含量。

1.7.3 醋酸致小鼠扭体实验 末次给药1 h后，各小鼠注射醋酸溶液(0.6 %)0.2 mL，计时15 min，记录其扭体次数(腹部收缩内凹、伸展后肢、臀部抬高)，以模型组与给药组小鼠扭体均数之差占模型组扭体均数的百分比表示抑制率[13]。

2 结果

2.1 白花蛇舌草主要活性成分的分析 得到7个活性成分，根据文献报道及筛选结果发现，E-6-O-P-Methoxycinnamoyl Scandoside Methyl Ester具有极高的类药性，Deacetyl Asperuloside Acid_Qt具有较高OB，共9个活性成分。见表1。

表1 白花蛇舌草主要活性成分

在TCMSP数据库中，除1、3、9号成分未匹配到相关靶点，其余成分获得相关靶基因173个。图1中有6个活性成分节点和173个靶基因节点，绿色菱形代表靶点，红色长方形是活性成分，浅蓝色长方形是药物名称，均以Degree值大小依次排列。活性成分按照度值排列为Quercetin(槲皮素)、Stigmasterol(豆甾醇)、2-Methoxy-3-Methyl-9,10-Anthraquinone、Beta-Sitosterol(Β-谷甾醇)、Deacetyl Asperuloside Acid_Qt、Poriferasterol；度值≥4的靶点有PTGS2、PTGS1、NCOA2、GABRA1、ADRB2、SCN5A。

图1 白花蛇舌草“活性成分-预测靶点”网络

2.2 白花蛇舌草活性成分和炎症靶点交集基因 从数据库中搜索8 297个疾病靶点相关信息，根据Relevance score值以中位数卡点，得1 046个靶点信息，绘制与成分靶点的交集基因的韦恩图，共得交集基因99个。见图2。

图2 白花蛇舌草活性成分与炎症靶点交集基因韦恩图

2.3 白花蛇舌草PPI网络的构建 根据Degree值大小将99个交集靶点按照形状由大到小、颜色由红到浅蓝色进行排序，度值≥60的靶点有IL-6、AKT1、TNF、VEGFA、TP53、PTGS2、JUN、MMP9、CXCL8、IL-1β、CASP3、EGF、EGFR、CCL2、MAPK1，度值越高表明此节点越重要。见图3。

图3 PPI网络及筛选结果

2.4 GO功能和KEGG通路的富集分析 GO分析选取P值前20项，分析结果发现，相关靶点在细胞分布上主要分布于膜筏、膜微区、膜区、细胞外基质等；分子功能主要集中于转录因子结合、细胞因子受体结合、细胞因子活性和RNA聚合酶Ⅱ转录因子结合等功能。参与的生物过程涉及脂多糖、细菌来源分子、毒性物质反应、应对受伤、细胞外刺激的反应、凋亡信号通路、氧化应激反应等。见图4。

图4 白花蛇舌草相关靶点的GO富集分析

KEGG富集到两百多条通路，其中癌症通路中Pathways in cancer相关靶点44个，为击中靶点最多的通路，前20项结果显示，所预测的相关靶点信息与炎症相关通路有：AGE-RAGE信号通路、TNF信号通路、IL-17信号通路，与其相关的靶点有AKT1、TNF、IL-6、PTGS2、VEGFA等。见图5。

图5 预测靶点KEGG通路富集分析

2.5 分子对接 将PPI网络中Degree值排名前6位的交集靶点AKT1(PDB ID 3CQW)、IL-6(PDB ID 4O9H)、TNF(PDB ID 2AZ5)、VEGFA(PDB ID 4KZN)，其中β-谷甾醇与AKT1结合能力最强，Poriferasterol、2-methoxy-3-methyl-9,10-anthraquinone、豆甾醇与5个靶点结合力普遍较强。见表2。

表2 分子对接结果(1 cal=4.184 J)

2.6 白花蛇舌草对小鼠耳肿胀的影响 白花蛇舌草水提液和醇提液均可显著减轻小鼠耳肿胀，降低小鼠血清中IL-6、TNF-α因子水平。见图6。在耳肿胀实验中，各给药组肿胀度与模型组比较，差异均有统计学意义(均P<0.05)，且以水提物高剂量组药效最好。此外，与对照组比较，2种提取物中、高剂量组均可明显降低小鼠血清中炎症介质IL-6水平和TNF-α水平，差异均有统计学意义(均P<0.05)。见表3。

表3 白花蛇舌草对二甲苯致小鼠耳缘肿胀反应模型的影响(n=8)

图6 白花蛇舌草提取物对耳肿胀小鼠血清中IL-6、TNF-α的影响

2.7 白花蛇舌草对醋酸致小鼠扭体的影响 白花蛇舌草水提物和醇提物均可明显减少醋酸致小鼠扭体次数；除水提物低剂量组外，各给药组与模型组比较，差异均有统计学意义(均P<0.05)，以水提物高剂量组镇痛效果最佳。见表4。

表4 白花蛇舌草对醋酸致小鼠扭体反应模型的影响(n=8)

3 讨论

白花蛇舌草是清热解毒的良药，现代临床研究以其抗肿瘤作用为主，但在传统古方中白花蛇舌草多用于治疗虫蛇咬伤等引起的红肿热痛，即现代医学常说的急性炎症[14]。本研究基于网络药理学方法，筛选得6个活性成分，173个相关靶点，取其活性成分和抗炎交集靶点99个，构建“靶点-成分”可视化网络，药物活性成分包括槲皮素、豆甾醇、2-Methoxy-3-Methyl-9,10-Anthraquinone、Β-谷甾醇、Deacetyl Asperuloside Acid_Qt、Poriferasterol，核心靶点有AKT1、IL-6、TNF、VEGFA、TP53、PTGS2等[15]。槲皮素具有广泛抗炎作用[16]；豆甾醇能显著抑制TNF-α、IL-6、IL-1β、诱导型一氧化氮合酶和环氧合酶2的表达，通过下调核因子κB、P65，抑制核因子κB抑制物磷酸化(Phosphorylation of Nuclear Factor-kappa B Inhibitorα，p-IκBα)活化，增加了抗炎因子IL-10的表达[17]；Β-谷甾醇能够最大程度地降低脂多糖诱导的RAW 264.7细胞中一氧化氮的产生，抑制巨噬细胞IL-6的活性，并减少TNF-α和IL-1β的分泌，达到抗炎效果[18]；2-Methoxy-3-Methyl-9,10-Anthraquinone尚未见文献报道相关抗炎作用。核心靶点中AKT1与细胞代谢、生存迁移和基因表达有关，可通过调节血管通透性发挥作用，导致水肿和白细胞外渗，对于急性炎症和组胺介导的血管渗漏至关重要[19]。IL-6是趋化因子家族中的细胞因子，能促进B细胞增殖分化，增强炎症细胞的浸润[20]；血管内皮生长因子A可促进体外血管内皮细胞的生长，诱导体内血管增生，增加血管的通透性，从而促进炎症介质的生成[21]；在急性炎症反应中，活化转录因子3(Activating Transcription Factor 3，ATF3)负调节前列腺素-内过氧化酶合酶(Prostaglandin-endoperoxide Synthase2,PTGS2),PTGS2轴失调可能会导致慢性炎症疾病中白细胞积累增加，前列腺素E2/前列腺素D2水平升高，PTGS2表达异常[22]。以上皆表明白花蛇舌草中6个活性成分可能作用于AKT1、IL-6、TNF、VEGFA、TP53、PTGS2等靶点发挥抗炎作用，分子对接也证明此结合的有效性。

GO和KEGG通路富集分析显示花蛇舌草通过不同途径调控体内多种信号通路。发挥抗炎效应的靶点主要参与TNF、IL-17、AGE-RAGE等信号通路。TNF是由巨噬细胞或单核细胞活化产生的细胞因子，其下游转导信号有核因子κB、细胞凋亡、JNK等信号通路途径，在炎症反应、肿瘤免疫等方面发挥重要作用[23]。IL-17是一种高度多功能的炎症介质，在宿主防御、组织修复、炎症疾病发病机制和癌症进展等多种过程中都至关重要[24]。

本研究进一步通过体内实验对白花蛇舌草的抗炎镇痛作用进行药效学的验证，结果显示其提取液可显著减轻二甲苯致小鼠耳肿胀，减少醋酸致小鼠扭体次数，降低血清中IL-6、TNF-α水平。体内实验水提物呈良好的“量-效”关系，提示白花蛇舌草提取液中水溶性成分越高，抗炎作用越有优势。此外，醇提液也有明显的抗炎作用，表明溶于水醇溶液中的抗炎成分同样不可忽视。

综上所述，白花蛇舌草可能通过Β-谷甾醇，Poriferasterol、2-Methoxy-3-Methyl-9,10-Anthraquinone、豆甾醇等关键成分影响AKT1、IL-6、TNF、VEGFA、PTGS2等关键靶点，影响TNF等信号通路，体现了白花蛇舌草治疗炎症作用的“多成分、多靶点、多通路”的特点，通过体内实验进一步验证其抗炎作用，推测其抗炎机制可能与抑制TNF-α和IL-6这2种炎症介质的生成有关，为白花蛇舌草抗炎机制的进一步研究提供参考。