孕酮对奶牛子宫内膜上皮细胞凋亡和容受性的影响

李 琦，秦 雪，冯 瑞，赵 骞，郑 鹏

(东北农业大学 动物科学技术学院，黑龙江 哈尔滨 150030)

奶牛的正常受胎和分娩是保证持续产奶的基础，随着奶牛的不断选育，奶牛的产奶量不断提高，而奶牛的繁殖力却逐年降低[1]，输精后35 d的妊娠率只有30%～50%，40%～60%的胚胎在妊娠识别和附植期间丢失[2]。胚胎附植又称胚胎着床，是胚胎到达子宫定位后，与子宫内膜上皮接触、黏附和附植的过程。正常情况下，子宫只有在某个特定时期允许胚胎附植，这一时期即为附植窗口[3]。此时，胚泡滋养层达到侵入状态，子宫内膜达到接受状态，且两者同步发生[4]。

奶牛胚胎在妊娠识别和附植期间，卵巢上的黄体分泌的孕酮是调控子宫内膜的同步化、保证胚泡成功附植的重要激素[5]。孕酮作用于子宫，刺激子宫腺的增长与分泌，抑制子宫肌的蠕动，为胚胎着床与发育创造了有利条件。奶牛妊娠早期，孕酮不足可导致妊娠率降低[6-7]。LPEZ等[8]研究发现，配种后第5天，乳汁中孕酮质量浓度大于3 μg/L的母牛受胎率为50%，而孕酮质量浓度小于1 μg/L的母牛受胎率仅为10%。因此，黄体功能不足、分泌孕酮水平过低，是导致奶牛早期胚胎附植率低的主要原因。

本试验使用孕酮处理奶牛子宫内膜上皮细胞，研究孕酮对子宫内膜上皮细胞凋亡和容受性的影响，为进一步明确孕酮调控奶牛子宫容受性的机制奠定基础，为在生产中提高奶牛繁殖力提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 细胞及主要试剂牛子宫内膜上皮细胞由本实验室保存，培养皿(Corning)，DMEM/F12(Hyclone)，FBS(Gibco)，双抗(10 000 U/mL的青霉素和10 g/L的链霉素，Biosharp)，孕酮(Sigma)，CCK8试剂盒(Bimake)，Cytokeratin 18(KRT-18，Bioss)，TRIzol(Invitrogen)。

1.2 免疫荧光染色解冻牛子宫内膜上皮细胞，使用 DMEM/F12+10% 胎牛血清(FBS)+1% 双抗，在37.5℃、5% CO2条件下培养。细胞生长到80%以上时，传代到60 mm培养皿内，培养48 h后进行免疫荧光染色。参考WANG等[9]的方法，步骤为：PBS清洗3次，4%多聚甲醛固定15 min。5% 牛血清白蛋白(BSA)室温封闭1 h。用1% BSA稀释的一抗(KRT-18)在4℃孵育过夜。PBS清洗3次，1% BSA稀释的荧光标记二抗在室温孵育1 h，用DAPI复染5 min。PBS清洗3次后，荧光显微镜观察。

1.3 孕酮质量浓度的筛选牛子宫内膜上皮细胞生长到80%以上时，将细胞传代至96孔培养板内(每孔104个细胞)，培养12 h后加入不同质量浓度的孕酮(10，25，50，100 μg/L)，24 h后加入10 μL的CCK8试剂，37℃孵育2 h，在450 nm波长下检测，根据D450 nm值计算细胞活力。

1.4 细胞培养与处理牛子宫内膜细胞生长到80%以上时，传代至60 mm培养皿内继续培养。24 h 后，将培养皿分3组，每组使用3个60 mm培养皿，分别为对照组和孕酮组(10，100 μg/L)，继续培养24 h，用于接下来的试验分析。

1.5 流式细胞术检测细胞凋亡按照凋亡检测试剂盒(Vazyme)说明书进行检测。试验分为对照组和孕酮组(10，100 μg/L)。将细胞接种在60 mm培养皿内，处理后的细胞用不含EDTA的胰酶消化细胞，终止消化后收集细胞，4℃、1 000 r/min离心5 min，弃上清；用预冷的PBS洗涤细胞2次，每次均在4℃、1 000 r/min离心5 min后弃上清；加入100 μL 1×Binding Buffer，吹匀至单细胞悬液，加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI Staining Solution吹匀，避光室温孵育10 min，加入400 μL 1×Binding Buffer混匀；染色后样品在1 h内用流式细胞仪检测。

1.6 实时荧光定量RT-PCR参考HUANG 等[10]的方法，使用TRIzol试剂提取牛子宫内膜上皮细胞的总RNA，进行反转录，采用实时定量RT-PCR检测p53、Cyto-c、Bax、Bcl-2、Caspase-8、Caspase-9、Caspase-3、TLR-4、NF-κB、IL-6、VEGF、LIF、EGF和β-actin的表达。引物序列见表1，由华大基因公司合成，内参基因为β-actin，用2-ΔΔCt法计算靶基因的表达水平。

表1 引物信息

1.7 Western blot检测参考ADEGOKE等[11]的方法，将处理后的细胞用PBS洗涤，用胰蛋白酶消化收集，再次用PBS洗涤细胞2次，去除上清液后，加入150 μL RIPA裂解缓冲液进行蛋白提取。用BCA蛋白检测试剂盒检测蛋白浓度。采用10% SDS-PAGE电泳分离蛋白，转膜后，用5%脱脂奶粉封闭1 h，然后与一抗(p53、Bax、Cyto-c、Caspase-8、Caspase-9、Caspase-3、VEGF、LIF和β-actin；1∶1 000，Bioss公司)在4℃过夜孵育。清洗膜3次，每次10 min，用二抗(HRP标记，1∶3 000，Bioss公司)在室温下孵育1 h。洗涤3次，用ECL-Western blot检测系统检测(Amersham Biosciences)。用Image J软件进行灰度分析。

2 结果

2.1 牛子宫内膜上皮细胞的免疫荧光染色显微镜下观察可见，牛子宫内膜上皮细胞呈典型的上皮样细胞，用KRT-18(细胞角蛋白-18)进行免疫荧光染色，细胞质被染成绿色，细胞核被DAPI染成蓝色。证实该细胞为牛子宫内膜上皮细胞(图1)。

A.KRT-18染色；B.DAPI染色；C.合成图

2.2 孕酮对子宫内膜上皮细胞活力和凋亡的影响使用CCK8检测了不同浓度的孕酮对细胞活力的影响，结果显示，孕酮对细胞活力的影响不显著(图2)(P>0.05)。分别使用10 μg/L(牛体内的生理质量浓度)和100 μg/L的(高质量浓度)孕酮处理细胞，流式细胞术检测结果显示，不同质量浓度的孕酮处理对细胞凋亡未见显著影响(图3)(P>0.05)。

相同字母表示组间差异不显著，不同字母表示组间差异显著，P <0.05。下同

A.对照组；B.10 μg/L；C.100 μg/L；D.流式细胞分析数据统计

2.3 孕酮对子宫内膜细胞凋亡基因表达的影响荧光定量RT-PCR结果显示，孕酮对牛子宫内膜上皮细胞Bax、Bcl-2、p53、Cyt-c、Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9的mRNA表达没有显著改变(图4)(P>0.05)。Western blot分析显示，孕酮对牛子宫内膜上皮细胞Bax、p53和Caspase-9的蛋白表达没有显著改变(图5)(P>0.05)。

A～H.分别为Bax、Bcl-2、Bcl-2/Bax、p53、Cyt-c、Caspase-9、Caspase-8、Caspase-3

A.Western blot;B～D.Bax、p53、Caspase-9

2.4 孕酮对子宫容受性相关因子表达的影响荧光定量RT-PCR结果显示，孕酮显著增加了LIF和VEGF的mRNA表达，降低了TLR-4的表达(P<0.05)，对NF-κB、IL-6和EGF的表达没有影响(图6)(P>0.05)。Western blot分析显示，孕酮显著下调了TLR-4的蛋白表达水平，上调了LIF和VEGF的蛋白表达水平(图7)(P<0.05)。

A～F.分别为TLR-4、LIF、VEGF、NF-κB、IL-6、EGF

A.Western blot;B～D.TLR-4、LIF、VEGF

3 讨论

附植期间孕酮分泌不足会影响胚胎附植，尤其是高产奶牛肝脏代谢旺盛，高的代谢率使血浆中孕酮等类固醇激素在肝脏中被代谢，血液循环中孕酮浓度随之降低，导致胚胎丢失率上升[12]。为此，很多学者在奶牛配种后补充外源性的孕酮，用来降低早期胚胎丢失率，提高奶牛的妊娠率[13-14]。FORDE等[15]发现，补充孕酮可以改变胚胎发育阶段子宫内膜关键基因的表达模式，对预防早期胚胎丢失具有重要意义。然而，孕酮调控子宫内膜的具体机制还不清楚。

大量研宄证实，孕酮作用于表达孕酮受体的所有类型细胞，对细胞的增殖及其相应激素受体的表达都有重要的调节作用[16]。CUI等[17]研究表明，孕酮对子宫内膜上皮细胞的增殖没有影响。NGUYEN等[18]研究表明，孕酮显著促进子宫内膜癌细胞和卵巢癌细胞的凋亡，而对正常的子宫内膜细胞和卵巢基质细胞没有影响。FAKOWSKA等[19]研究表明，高浓度的孕酮显著促进子宫基质细胞的增殖，对子宫内膜上皮细胞的影响不显著。WANG等[20]研究显示，孕酮对奶牛子宫内膜细胞的增殖与凋亡没有影响，但能缓解干扰素引起的凋亡，却不能缓解放线菌酮(cycloheximide，CHX)引起的凋亡。奶牛胚胎附植期，奶牛体内孕酮质量浓度维持在5～15 μg/L[3-8]，本试验使用的孕酮质量浓度为10～100 μg/L，结果显示，孕酮对于子宫内膜上皮细胞的活力、增殖和凋亡没有明显的作用。因此，单独的孕酮处理，不能引起子宫内膜上皮细胞的凋亡[21-23]。

黄体形成后，持续分泌的孕酮可使子宫内膜增厚，减少子宫在妊娠期间的收缩活动，抑制母体对胎儿的免疫排斥反应，抑制发情活动，促进子宫血管扩张，以利于胚胎着床[24]。LIF是胚胎着床的重要细胞因子，LIF表达降低，会导致小鼠的胚胎无法着床[25]，奶牛胚胎移植时，添加LIF可使奶牛的妊娠率显著提高[26]。本试验结果显示，孕酮提高了子宫内膜上皮细胞的LIF表达，预示着LIF对奶牛胚胎的附植具有重要的调节作用。胚胎着床时，胚胎滋养层细胞和子宫内膜上皮细胞相互作用，形成新的组织。新组织的形成常伴随着新生血管的形成，为新生组织的增殖和分化提供了营养供给[27]。血管内皮生长因子(VEGF)是一种促进血管生成和调节血管通透性的细胞因子，其对内皮细胞的增殖起到促进作用[28]。本试验结果显示，孕酮可促进VEGF的表达，因此，孕酮在调控胚胎滋养层细胞和子宫内膜上皮细胞的相互作用中发挥重要的调节作用。

子宫腔与外界相通，具有固有的防御体系。当子宫发生感染时，子宫的防御体系发生一系列反应来清除病原微生物。家畜妊娠后，黄体分泌的孕酮能降低淋巴细胞和中性粒细胞的活性，抑制子宫和外周血的中性粒细胞的吞噬活性[29]，对子宫的免疫应答产生一定的影响。TLR4/NF-κB是调控机体的炎症反应和免疫应答过程中的重要细胞信号通路，之前的研究表明，当细胞受到外界刺激，活化TLR-4/NF-κB/IL-6后，使用孕酮能显著降低TLR-4/NF-κB/IL-6的表达[30-31]。本试验结果表明，孕酮能够抑制TLR-4的表达，但对NF-κB和IL-6的表达没有影响，这可能是由于细胞没有受到外界刺激，没有产生炎症和免疫反应，所以，单独的孕酮处理，不能降低细胞的NF-κB和IL-6的表达。

综上所述，孕酮不影响奶牛子宫内膜上皮细胞的凋亡，但能提高子宫容受性，降低免疫反应。