石墨烯量子点的制备及其在生物医学领域的应用

喻飞宇，吴惠霞

（上海师范大学化学与材料科学学院，上海 200234）

0 引言

石墨烯量子点（GQDs）因为其优良的生物相容性、出色的发光性能、较大的比表面积等特性，而受到研究者们的广泛关注.目前，GQDs已经在许多领域得到了应用，其中，应用于生物医疗领域是研究的热点.

GQDs由小于10层的石墨烯薄片组成，其尺寸小于100 nm.这一特性令GQDs在结构上不同于球形的碳点（Cd）.与石墨烯类似，GQDs具有某些显著的特征，如高导电性、优异的机械强度和热稳定性.与石墨烯不同，基于先前的理论计算和实验研究，GQDs被证明具有带隙，带隙的存在使其具有产生电子-空穴的能力，这种独特的性质拓展了石墨烯材料的应用范围.同时，由于边缘和量子限制效应，GQDs具有更好的表面接枝能力、良好的生物相容性、低毒性、化学惰性、稳定的光致发光能力和高分散性.其中一些特性适合应用于许多领域，包括药物输送、储能、生物成像、生物传感以及肿瘤治疗.GQDs还可以通过掺杂杂原子、与聚合物或其他材料形成复合材料来实现功能化，如氮（N）掺杂的石墨烯量子点（NGQDs）用于声动力治疗［1］，氮硼共掺杂的石墨烯量子点（N，B-GQDs）用于肿瘤的光热治疗（PTT）［2］等.

GQDs的合成策略通常分为两大类，即自上而下流程和自下而上流程.在自上而下的方法中，石墨烯、炭黑等块体碳材料通过化学/电化学剥离、水/溶剂热处理、微波/超声等方法进行裂解，切割形成GQDs.尽管自上而下的方法，原料丰富、操作简单，非常适合大规模生产，但非选择性的化学切割会导致对最终产品的尺寸和形貌控制不佳.自下而上的策略是基于小的前体分子（环状分子、聚合物）通过碳化、热解、化学气相沉积等方法逐渐生长成纳米级的GQDs，具有高度的可控性和较少的缺陷.然而，产物的溶解性和聚集性差是主要的限制因素，因此选择合成方法时需要仔细考虑.本文作者主要介绍GQDs的制备，及其在生物医疗领域中的应用.

1 GQDs的制备方法

1.1 自上而下策略

1.1.1 化学剥离法

化学剥离法是指用强氧化剂和强酸对氧化石墨烯（GO）、碳纳米管（CNTs）、碳纤维等先驱体碳材料进行剥离.这是一种简便、直接、廉价的合成方法，可用于大规模生产高质量的GQD.PENG等［3］用浓硫酸（H2SO4）和浓硝酸（HNO3）的混合酸剥离碳纤维制备GQDs.由于搅拌温度不同（80，100和120℃），得到的GQDs的尺寸范围为1～11 nm，分别发射蓝色、绿色和黄色的荧光，而原子力显微镜显示GQDs的高度在0.4～2 nm左右，表明石墨烯层数为单层到少数几层.值得一提的是，碳纤维sp2结构域的化学切割决定了GQDs的形成.

1.1.2 电化学剥离法

石墨、碳纤维、GO和多壁碳纳米管（MWCNTs）已被用作合成不同尺寸和层数的量子点的前体.例如，TAN等［4］通过在0.01 mol·L-1过硫酸钾水溶液中，于+5.0 V电势下电解石墨棒来合成3 nm均匀尺寸的GQDs.观察到过硫酸钾作为支持电解质，对于制备在365 nm辐射下产生红色荧光的GQDs起重要作用.当硫酸钠用作支持电解质时，观察到非常弱的红色荧光，而当采用高铁酸钾代替过硫酸钾时，没有观察到荧光.这表明硫酸盐电解质的选择对于红色荧光量子点的产生至关重要.硫酸根离子（SO42-）在高阳极电压下放电，产生过硫酸根离子（S2O82-）.S2O82-，又经过电化学反应，产生强氧化性的硫酸根自由基SO4

-·，它的存在充当了电化学“剪刀”，通过氧化C-C键将石墨烯薄片切割成小而完整的sp2结构，这是产生GQDs的关键因素［4］.

1.1.3 水热/溶剂热剥离法

与其他合成方法相比，水/溶剂热剥离是制备量子点的一种简化方法.PAN等［5］首次通过水热法制备了蓝色发光量子点.在热处理之前，GO片被化学氧化，因此，生成的GO碳晶格具有几个环氧基.这些环氧基团作为一个分裂点，在水热反应过程中被完全破坏，产生GQDs.一些研究人员利用氧化剂或温和的氧化剂来加速整个水热反应.例如，HALDER等［6］通过在过氧化氢（H2O2）存在下，一锅水热剥离GO片来制备GQDs.值得注意的是，H2O2在热处理过程中有效地剪切GO片，因此显著加速了剥离反应.得到的量子点直径为5 nm，具有高的光稳定性和无细胞毒性.WANG等［7］通过一锅水热剥离反应，制备了硫（S）掺杂的GQDs（S-GQDs）.所得到的S-GQDs结构是高度结晶的，它们的尺寸范围为2～6 nm，平均流体动力学直径为4 nm.厚度为0.5～1.0 nm，显示了单层至几层厚的S-GQDs.由于硫的掺杂，S-GQDs表现出显著的光致发光性能，其光致发光量子产率（79%）比大多数已报道的量子点高得多，并且具有优异的光/化学稳定性.继水热法之后，BOONTA等［8］最近开发了N和S共掺杂的量子点（N，S-GQDs），分别使用柠檬酸作为碳源和半胱胺盐酸盐作为氮和硫源.所得N和S共掺杂GQDs的平均流体力学尺寸为3.0 nm，尺寸分布为1.1～5.4 nm.由于钴离子与碳（C）、表面N和S的官能团相互作用，通过金属-配体相互作用机制，共掺杂量子点被用于钴离子的荧光传感.同时，N和S共掺杂GQDs具有优异的光热效果，可以用于癌症的PTT.

1.1.4 微波/超声辅助剥离法

由于依赖于常规加热源（如油浴、电烘箱），化学/电化学和水热剥落方法通常需要较长的反应时间，因此不适用于大规模工业生产GQDs.相反，微波辐射通过提供均匀的热量，能显著缩短反应时间，从而可以快速形成高质量的GQDs.因此，将微波辐射与其他剥离方法相结合是一种有效的策略，可以在更短的时间内获得高产量的GQDs.LI等［9］首次报道了在酸性条件下通过微波辅助化学裂解GO片制备GQDs的方法.酸性裂解在GO片层上诱导了多个环氧基，这些环基在微波处理下很容易破裂，从而导致绿色荧光GQDs的形成，如图1（a）所示.他们进一步通过用硼氢化钠（NaBH4）还原绿色GQDs的表面官能团来制备蓝色荧光GQDs.通过同时触发酸性裂解和还原反应，利用微波辐射将氧化和还原步骤结合在一起，一步法制备了GQDs.如图1（b）所示，LUO等［10］报告了白色荧光GQDs（WGQDs）的两步制备.首先，在微波辅助的酸性裂解作用下，石墨转变为黄绿色荧光GQDs，然后通过微波辅助水热（MAH）处理GQDs，得到WGQDs.

图1 微波/超声辅助剥离法示意图.

除了微波辅助剥落外，超声辅助剥落也已用于GQDs的简便温和制造.简而言之，超声波会在液体中产生交替的高/低压波，从而导致不断形成小真空气泡，并使其突然崩溃.最终，这些空化产生了高速液体射流和强大的流体动力剪切力用以解除材料团聚［11］.利用这些功能优势，超声是一种将碳基前体的分层结构破碎成GQDs的有利策略.如图1（c）所示，ZHUO等［12］首次从石墨烯中，通过直接超声剥落制备了GQDs.之后，研究者们就探索了一系列碳材料，例如廉价的石墨、碳纤维、MWCNTs和GO等，用于在有机溶剂或水溶液中超声制备GQDs［13］.

1.2 自下而上策略

1.2.1 碳化/热解法

基于小分子/有机物前体的碳化是制备GQDs的一种简单的方法，因此近年来已被广泛探索.具体而言，小的有机基前驱物分子在高于其熔点的温度下加热，可以触发碳成核，凝聚以及后续GQDs的形成.此种方法使用了许多前体，包括有机盐、乙醇胺、乙酰丙酮、氨基酸、辅因子（抗坏血酸）、腐殖酸、咖啡渣、碳水化合物（蔗糖或葡萄糖）、柠檬酸等，用于制备GQDs［13］.值得一提的是，不同类型的GQDs的制备在很大程度上取决于所选的前驱体.例如，选择盐酸（HCl）和果糖作为Cl源和C源来制备Cl-GQD［14］.在水热处理下，果糖内存在的O和H基团被脱水，而C则形成了GQDs的核.同时，HCl发生催化反应，并提供Cl掺杂剂.YIN等［15］通过使用柠檬酸铵作为C和N的前体合成高荧光N-GQDs.柠檬酸铵的均相水溶液在高温（200℃）下碳化，产生GQDs，如图2（a）所示.遵循类似的概念，有机前驱物也可以被碳化以制造杂原子共掺杂的GQDs.QU等［16］分别以硫脲和柠檬酸为前体制备了N，S共掺杂的GQDs（N，S-GQDs）.硫脲提供S和N原子，而柠檬酸被用作C源.在实验中，首先将2种前体有效地溶解在二甲基甲酰胺（DMF）中，然后在180℃加热罩中进行热处理.纯化的GQDs厚度为1 nm，直径为4.5 nm，由于N和S的共掺杂而表现出荧光特性.

对于热解介导的GQDs的制备，前体分子通常分为两类：芳香族（如苯并二氢呋喃、六苯并蔻（HBC））和非芳香族（柠檬酸、葡萄糖等）.芳香族分子具有π体系，即存在离域轨道，可以直接进行热解制备GQDs，但非芳香族前体分子需要进行分子内和分子间脱氢才能合成GQDs［17］.LEE等［18］以D-葡萄糖为前体制备了单晶GQDs.所制备的GQDs显示出蓝色荧光，具有六边形晶体结构，并且横向尺寸为5 nm.TANG等［19］使用葡萄糖作为前体，在氨（NH3）存在下合成了N-GQDs.他们认为，NH3不仅原位掺杂了N，而且可以使葡萄糖的分子间/分子内脱氢，如图2（b）所示.由于石墨烯片段与HBC和其他多芳烃（PAH）的相似性，基于PAH的前体分子的可控热解证明了GQDs的产生［20］，如图2（c）所示.除了多环芳烃外，ZHU等［21］还使用了一种含氮芳香族化合物作为前体（如三聚氰胺）在高温（800～1 200℃）和压力（4.0 GPa）下合成N-GQDs.所得的N-GQDs显示出可调节的带隙，具有石墨性质，并且碳晶格中的N掺杂没有任何表面官能团.

图2 碳化/热解法示意图.

1.2.2 逐步有机合成/开笼法

通过逐步有机合成来制备GQDs是一种有效的溶液化学方法，可提供形貌均匀且清晰的GQDs.尽管通过逐步有机合成在制备GQDs方面取得了重大进展，但产生的GQDs的水溶性差，以及由于副反应而可能导致分子尺寸较大是其主要瓶颈［17］.此外，由于π-π相互作用而导致的低产量以及溶液中GQDs的聚集，需要在工业上进行改良.通常，脂侧链与芳香族分子的相互作用，使石墨烯薄片彼此更靠近，从而触发GQDs聚集.因此GQDs边缘的表面改性可以避免量子点发生聚集，使GQDs的分散性得到提高.

1.2.3 化学气相沉积法

化学气相沉积（CVD）是制备2D石墨烯的普遍方法.在CVD技术中，氢气（H2）和C源的流量、生长时间、温度以及基材的表面形态是关键参数，它们决定了最终产品的尺寸.通过调整这些参数，可以加快石墨烯的成核速率，使其超过生长速率，从而减小最终石墨烯产品的尺寸.

2 GQDs在生物医疗领域的相关应用

2.1 癌症治疗

基于GQDs的药物递送系统在生物医学和纳米医学中有多种应用，可以利用多功能GQDs进行靶向细胞成像，这对于癌症治疗以及诊断具有重大意义.作为石墨烯家族中的一员，由于其低毒性、大的比表面积和强大的表面功能化能力，GQDs在药物递送中具有许多其他纳米粒子无法比拟的优势.如，GQDs可以为药物提供更多结合位点，并提高细胞摄取能力.WANG等［22］以环状精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸多肽（RGD）修饰的GQDs为载体，制备了一种新型的化疗-光热联合治疗的给药系统.首先利用硫醇化反应将GQDs与环肽cRGD偶联，在使用SPDP修饰的聚乙二醇（PEG-SPDP）作为交联剂，将巯基化的多肽cRGD（cRGD-SH）连接到胺化石墨烯量子点（GQDs-NH2）上，通过透析处理得到cRGD修饰的GQDs，随后在材料上装载化疗药物阿霉素（DOX），如图3所示.DOX药物负载率高达96.6%，装载DOX和靶向环肽的石墨烯量子点（R-GQDs@DOX）复合材料，在释放DOX时表现出明显的pH敏感性.在pH=7.4的缓冲液中，DOX的释放少，而在pH=5.5的缓冲液中DOX的释放量显著增加.因此，此系统可以有效地响应肿瘤酸性微环境进行药物运输.同时，R-GQDs@DOX也具有良好的光热性能，在808 nm激光照射下，R-GQDs@DOX能使温度显著升高，这证明了R-GQDs@DOX也可以用于PTT.

图3 R-GQDs@DOX纳米颗粒的制备示意图及其在808 nm激光照射下光热升温效果

HU等［23］利用强酸剥离CNTs得到GQDs，将其与一种半导体聚合物纳米复合材料（SPN）相结合，得到了增强纳米酶GQDs-SPNs，它通过光热效应为肿瘤提供增强的纳米酶活性.近红外光照射可以引导肿瘤局部温度升高，促进内源性H2O2分解为·OH.并且可以与SPNs产生的1O2协同作用杀伤癌细胞，如图4所示.

图4 （a）GQDs-SPNs的合成和（b）光热效应增强GQD-SPN/纳米酶介导的癌症治疗机理的示意图

通过对GQDs进行杂原子掺杂可以使其具备声敏性，YANG等［1］制备了一种具有吡咯氮和吡啶氮结构的N-GQDs，其声敏化效果是传统声敏剂（如卟啉、卟啉Mn、卟啉Zn、TiO2等）的3～4倍.其独特的吡啶N和吡咯N结构在超声处理过程中作为催化中心产生1O2.量子点经叶酸修饰后，对荷瘤小鼠进行声动力治疗，在体内和体外实验中均表现出较高的抑瘤率（90%），如图5所示.

图5 FA-N-GQDs用于肿瘤声动力治疗的过程示意图

2.2 生物成像

由于稳定的光致发光、低的细胞毒性、优异的溶解度和生物相容性，GQDs被证明是生物成像的极佳探针.在早期研究中，ZHU等［24］报道了大规模合成有强烈绿色荧光的GQDs的方法.产生的GQDs显示出显著的荧光，荧光量子产率为11.4%.此外，这种GQDs易于溶于水和大多数极性有机溶剂，从而无需进一步的化学修饰.ZHANG等［25］利用强氧化剂处理石墨得到了约10 nm的GQDs，它表现出良好的生理溶解性、高光稳定性、低细胞毒性和黄绿色荧光，量子产率约为7%.在GQDs的生物成像应用领域，仍有一些重要的问题需要解决.尽管通过不同的方法，制备了具有从紫外到近红外发射波长的GQDs，但是这些GQDs的量子产率明显低于传统的半导体量子点.因此，提高GQDs的量子产率是十分必要的.如图6所示，XIN等［26］使用自上而下的方法，制备了不同结构的氮掺杂石墨烯量子点（NGQDs），这种GQDs以石墨为前驱体，过硫酸铵为N源，H2O2为氧化剂，N-甲基-2-吡咯烷酮为溶剂进行合成.而且首次使用溶剂萃取法提纯GQDs，分离后含有绿色荧光NGQDS（占总量的88%）和蓝色荧光NGQDS（占总量的12%）.经计算，绿色荧光NGQDs（NGQDs-d）和蓝色荧光NGQDs（NGQDs-w）两者量子产率分别为63.8%和26.2%，荧光量子产率相较于之前的研究得到了相当大的提高，这种材料可以作为生物样品的荧光标记物.

图6 具有绿色荧光NGQDs（NGQDs-d）和蓝色荧光NGQDs（NGQDs-w）的合成示意图以及细胞成像图

2.3 生物传感

除了生物成像外，GQDs的光学特性还被用于生物传感.不同于生物成像，GQDs在生物传感中的作用是检测和指示生物分子的存在.基于GQDs的生物传感器，利用GQDs中特定官能团与被分析的生物分子之间的亲和力，当被检测生物分子连接到GQDs上特定官能团时，两者之间的缔合可以提供不同的电子态.随后，GQDs的电子结构发生改变，荧光强度也发生变化.因此，可以利用荧光强度的变化作为指示来检测一些生物分子.目前，基于GQDs的生物传感器已经被证明能够检测离子、DNA和其他各种代谢物［11，27］.ARUMUGASAMY等［28］将GQDs和功能化的MWCNTs复合到玻碳电极（GCE）表面，获得了用于检测多巴胺含量的电化学生物传感器（GQDs@MWCNTs），如图7所示.该传感器对多巴胺具有良好的催化活性，利用差式脉冲伏安法在0.25～250 μmol·L-1的范围内进行测定，其检出限为

图7 GQDs@MWCNTs纳米复合材料合成的总体反应方案示意图

95 nmol·L-1.

3 总结与展望

GQDs作为一种新型材料吸引了众多科研人员的目光，由于边缘和量子限制效应，其具有更好的表面接枝能力、良好的生物相容性、低毒性、化学惰性、高的光稳定性、稳定的光致发光能力和良好的溶解性等特点，是当下许多研究领域的热点.其中，GQDs在生物医学领域具有巨大的潜力，例如生物成像、生物传感、药物输送和癌症治疗.

尽管GQDs已经取得了显著的进展，并已被证实其显著的优势，但由于一些尚未解决的问题，如对于GQDs发光机制认识的不足，严重制约了量子产率的进一步提高，尽管人们提出了表面态、量子限制效应、表面修饰、边缘态、掺杂、尺寸效应等多种发光机制，但目前还没有一个清晰、详细、充分的发光机制解释，故GQDs的潜在生物成像应用还没有得到充分的开发.另外，由于GQDs的光学和电学性质强烈依赖其尺寸和形貌，所以如何控制形成高质量、窄尺寸分布的单层GQDs仍然是一个挑战.总之，对于GQDs的各项研究仍处于一个探索阶段，随着探究的不断深入，GQDs作为一种新型多功能材料在生物医疗领域或将得到更为广泛的应用.