UPLC-MS/MS法检测电子烟烟液和气溶胶中的8种酚类化合物

罗君君，梁晶晶，李馨铎，姜兴涛，吴泽宏

烟草与烟气化学

UPLC-MS/MS法检测电子烟烟液和气溶胶中的8种酚类化合物

罗君君，梁晶晶，李馨铎，姜兴涛，吴泽宏*

深圳雾芯科技有限公司RELX实验室，广东省深圳市宝安区建安一路9号 518051

【目的】建立一种定量检测电子烟烟液和气溶胶中8种潜在有害酚类化合物的方法，应用于电子烟产品的日常品质监管中。【方法】方法学的建立以电子烟烟液为样本，电子烟烟液经50%甲醇稀释后，利用液相-串联质谱联用仪（UPLC-MS/MS）测定，考察该方法的专属性、线性、检测限和定量限、准确度、精密度、以及溶液稳定性等。【结果】本方法中苯二酚、双酚A和剩余6种酚类化合物浓度分别在10～500 μg/mL（2= 0.994）、0.02～1.00 μg/mL（2= 0.998）和0.2～10.0 μg/mL（2= 0.995～0.999）范围内时，线性关系良好；重复性测试溶液中各成分的RSD范围为3.6%～6.7%；各浓度加标溶液回收率为80.0%～119.2%；不同存储条件下样本稳定性良好。【结论】本方法检测速度快、专属性高、稳定性强，可用于准确有效检测电子烟烟液和气溶胶中的8种酚类化合物，并能高效应用于电子烟产品的品质管控中。

酚类化合物；UPLC-MS/MS；电子烟烟液；电子烟气溶胶

电子烟作为新型尼古丁传输系统，其烟液及气溶胶中的化学成分也是各国监管机构所重点关注的监测指标。因此，对电子烟烟液及气溶胶中各类有害及潜在有害成分（HPHCs）检测方法的开发很有必要。

部分简单酚类化合物（如苯酚、苯二酚、甲酚、双酚A等）属于HPHCs中的一类，它们不但具有刺激性气味，而且还会对皮肤及呼吸道黏膜产生强烈的刺激作用和致癌作用[1]，其中，苯酚被FDA列为烟草产品中93种HPHCs的成分清单之一，美国公布的苯酚立即威胁生命和健康（Immediately Dangerous to Life or Health，LDLH）浓度为100 μg/g。对苯二酚、间苯二酚和邻苯二酚均为工业上重要的二元酚，对苯二酚对中枢神经、呼吸系统有刺激作用，属于低毒性成分，间苯二酚和邻苯二酚对眼睛和皮肤具有一定刺激作用[2]。甲苯酚具有邻甲酚、间甲酚和对甲酚三种异构体，主要作为其他工业品的合成原料或用作染料、杀菌剂和消毒剂等。甲苯酚的毒性与苯酚类似，对皮肤和黏膜有一定刺激性，三种异构体中邻甲酚毒性最大，间甲酚毒性最小。双酚A（BPA）是一类典型的内分泌干扰物质[3]，属于低毒性化合物，其对皮肤、呼吸道、消化道和角膜均有中等强度刺激性，每天人类摄入BPA的最大量是1.0 µg/kg[4]。这8种酚类化合物的大鼠经口LD50（半数致死剂量）如表1所示。这些酚类化合物均被加拿大政府列入烟草46种有害成分名单和WHO“烟草制品管制研究小组”列为建议管制成分清单[5]。

卷烟烟气中酚类成分的测定已有较多报道，主要涉及的方法包括液相色谱法[6]、气相色谱法[7]等。根据我国烟草行业标准YC/T 255—2008[8]，采用高效液相色谱（HPLC）法测定卷烟主流烟气中的酚类成分所需时间较长，无法满足快速、大批量测定的需求。而且电子烟烟液和气溶胶中酚类化合物的含量普遍较低，HPLC法的检测精度无法满足实际的检测需要，因此急需开发新的检测方法以满足电子烟烟液和气溶胶中低含量酚类化合物的检测要求。现阶段电子烟烟液中酚类化合物的检测分析少见报道，仅有少数关于电子烟气溶胶中酚类成分的分析。2012年，Lauterbach等[9]对按照CORESTA推荐的电子烟抽吸方法（即55 mL/puff，每口抽吸3 s，抽吸间隔30 s）下产生的电子烟气溶胶中的酚类化合物进行了检测，结果显示，气溶胶中邻甲酚的含量为0.40mg/L，间甲酚与对甲酚的总含量低于0.56mg/L。

超高效液相色谱-串联质谱法（ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）可以在短时间内实现多种目标物的分离鉴定，排除复杂基质的干扰，具有专属性好、灵敏度高、快速等优点。因此，本研究旨在利用UPLC-MS/ MS建立一种能够准确、定量检测电子烟烟液和气溶胶中常见上述8种具有潜在健康风险的酚类化合物的检测方法，并应用于电子烟产品的烟液和气溶胶中酚类化合物监测中，以期为电子烟质量控制与安全风险监管提供全面、快速和可靠的分析方法。

表1 8种酚类化合物的大鼠经口半数致死剂量（LD50）

Tab.1 The oral LD50 of 8 phenolic compounds in rats

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

液相质谱联用仪（三重四级杆）（Waters TQ-S micro）；超纯水（Milli-Q Direct）；色谱甲醇（HPLC，Supelco，批号：I1135807106）；乙酸铵（aladdin，批号：D2022010）；分析天平（万分之一，Mettler Toledo）；各量程微量移液器（10～100 μL、20～200 μL、100～1000 μL，Brand Transferpette）；CETI-8 V3.0电子烟吸烟机（Cerulean）；RELX无限电子雾化器及十种不同口味的电子烟烟液（规格均为1.9 mL，除清雅烟口味烟液中尼古丁浓度为5%，其他各口味烟液中尼古丁浓度均为3%）。

对苯二酚（纯度99.9%）、间苯二酚（纯度99.9%）、邻苯二酚（纯度99.7%）、苯酚（纯度99.9%）、对甲苯酚（纯度99.8%）、间甲苯酚（纯度99.2%）、邻甲苯酚（纯度99.5%）标准品均购自于坛墨质检标准物质中心；双酚A标准品（纯度99.8%）购自于Aladdin。

1.2 溶液及样品的制备

1.2.1 烟液样品溶液制备

称取待测烟液1.0 g至10.0 mL容量瓶中，加入50%甲醇稀释至刻度，摇匀即得。

1.2.2 烟气样品的收集

将不同口味电子烟样品用Cerulean吸烟机按照CORESTA建议的电子烟抽吸模式（抽吸容量55 mL，抽吸间隔30 s，抽吸持续时间3 s）对电子烟样品进行抽吸100口，采用单层剑桥滤片对电子烟烟气释放物中的粒相部分捕集。待抽吸完毕后，将剑桥滤片置于含有50%甲醇溶液10 mL的锥形瓶中，200 rpm速度振荡20 min，得待分析测试样本。

1.2.3 标准曲线溶液的配制

分别称取一定量的对苯二酚、双酚A及其他6种标准物质，利用甲醇溶液配制成对苯二酚浓度为500 μg/mL、双酚A浓度为1 μg/mL、其他6种标准物质浓度为10 μg/mL的混合母液（对甲苯酚和间甲苯酚合并计算）。然后利用50%甲醇溶液稀释不同体积的标准曲线混合母液，得到各标准曲线线性溶液，见表2。

表2 标准曲线溶液中各标准品的最终浓度

Tab.2 The final concentration of each standard in standard curve solution

1.2.4 专属性验证的溶液配制

标准品单标溶液，分别配制不同浓度的对苯二酚（10.0 μg/mL）、双酚A（0.1 μg/mL）、及其他6种标准物质（1.0 μg/mL）的单标溶液；烟液样品溶液，称取1.0 g烟液至10.0 mL容量瓶，加入50%甲醇溶液稀释至刻度；烟液加标样品溶液，称取1.0 g烟液至10.0 mL容量瓶，加入混合标准溶液1.0 mL，加入50%甲醇溶液稀释至刻度。

1.2.5 线性检测溶液配制

同标准曲线母液的配制。

1.2.6 定量限和检测限溶液配制

定量限测试溶液，以线性最低点作为定量限测试溶液。检测限测试溶液，加入适量的超纯水溶液稀释双酚A浓度为0.001 μg/mL，对苯二酚浓度为0.500 μg/mL，其他组分浓度为0.010 μg/mL，可根据实际测试结果调整稀释浓度，直至适合浓度。

1.2.7 准确度和精密度测试溶液配制

分别配制低中高浓度的准确度测试溶液，各浓度溶液平行配制3份。1.0 g电子烟液用少量50%甲醇溶液稀释后，加入适量的混合标准溶液，然后用50%甲醇溶液定容至10.0 mL。其中，低浓度准确度溶液中对苯二酚、双酚A及其他组分的终浓度分别为1.000、0.002和0.020 μg/mL；中浓度准确度溶液中对苯二酚、双酚A及其他组分的终浓度分别为10.00、0.02和0.20 μg/mL；高浓度准确度溶液中对苯二酚、双酚A及其他组分的终浓度分别为50.0、0.1和1.0 μg/mL。

精密度溶液配制同中浓度准确度溶液，平行配制6份。

1.3 仪器条件

色谱条件 色谱柱：HSS T3（2.5 μm 3.0×150 mm）；流动相：2 mmol/L乙酸溶液（流动相A）、色谱甲醇溶液（流动相B）、以及超纯水（流动相C）；流速：0.5 mL/min；柱温：30℃；进样室温度：10℃；进样量：3.0 μL；梯度洗脱程序如表3所示。

表3 UPLC-MS/MS色谱梯度洗脱条件

Tab.3 The chromatographic gradient elution conditions of UPLC-MS/MS

质谱条件 离子源为电喷雾离子源（ESI源），毛细管电压为负模式3.0 kV，脱溶剂气温度为450℃，脱溶剂气流速为1000 L/h，离子源温度为150℃，锥孔电压为20 eV，各成分的质谱多反应监测（MRM）参数见表4。

表4 8种酚类化合物的质谱多反应检测（MRM）参数

Tab.4 Multiple reaction detection (MRM) parameters of 8 phenolic compounds by mass spectrometry

注：NA表示分析条件下未发现定性离子。

Note: NA, means no qualitative ions were found under the analysis conditions.

1.4 实际样品分析

收集市面上常见的某品牌10种不同口味的电子烟烟液样品，对烟液或雾化后的气溶胶进行收集稀释处理，然后利用UPLC-MS/MS按照既定方法对10种电子烟烟液和气溶胶中的8种酚类化合物进行进样分析。

2 结果与讨论

2.1 方法学评价

2.1.1 专属性考察

分别进样分析空白溶液、单标溶液、电子烟烟液样品溶液和电子烟烟液加标样品溶液，按照1.3色谱条件和质谱条件分析。分析色谱图如图1所示，混标溶液中对苯二酚、间苯二酚、邻苯二酚、苯酚、对/间甲苯酚、邻甲苯酚和双酚A的保留时间分别为2.17、3.02、4.06、6.34、8.89、9.15、和12.20 min。其中除了对甲苯酚和间甲苯酚分离度较低，在混标中保留时间完全重合外，其他各峰之间无干扰，方法专属性良好。

图1 8种酚类成分标准品的色谱图及其保留时间

2.1.2 线性关系、检测限和定量限考察

将配制好的线性溶液按照1.3的仪器条件进样分析，以线性溶液中各个组分峰面积比值作为中坐标（），各个组分浓度作为横坐标（），绘制标准曲线，得到各成分的线性回归方程。以检测限溶液各个组分的S/N≥3:1，定量限溶液各组分的S/N≥10:1视为可接受标准分别做检测限（LOD）和定量限（LOQ），结果见表5。数据显示，8种酚类化合物所得直线回归方程的2值均大于0.99，满足可接受标准≥0.99，说明线性关系良好。

表5 8种酚类化合物在UPLC-MS/MS中的线性方程、相关系数2与线性范围及LOD与LOQ

Tab.5 Line equation, R2, Linear range, LOD and LOQ of 8 phenolic compounds in UPLC-MS/MS

2.1.3 准确度考察

依次将准确度溶液分别进样，记录峰面积，根据标准曲线，计算溶液中各组分的浓度，计算公式为：

以各准确度溶液回收率在80%～120%范围内为可接受标准。

用于准确度分析的低中高浓度的加标电子烟烟液样本（n = 3）准确度分析数据如表6所示，各个浓度的加标溶液的回收率为80.0%～119.2%，均满足可接受标准80%～120%。

表6 测试条件下8种酚类化合物的加标回收率（n = 3）

Tab.6 Recovery rates of 8 phenolic compounds under test conditions (n = 3)

2.1.4 精密度

将配制的溶液分别进样，记录峰面积，根据标准曲线，计算溶液中各个组分的浓度。以6份精密度溶液中各组分的浓度RSD≤10.0%作为可接受标准；不同人员重复进行6份精密度溶液分析和计算，以12份精密度溶液中各个组分的浓度RSD≤10.0%作为可接受标准。6个重复样本的分析数据和两名操作人员独立分析的重复数据如下。

日内RSD：数据显示，6份重复性测试溶液中对苯二酚、间苯二酚、邻苯二酚、苯酚、对间甲苯酚、双酚A的RSD为2.1%、1.3%、1.8%、0.9%、1.7%、3.6%、3.3%，各个组分的RSD最大为3.6%，均满足可接受标准≤10.0%。

日间RSD：12份测试溶液中对苯二酚、间苯二酚、邻苯二酚、苯酚、对间甲苯酚、双酚A的RSD为5.5%、6.7%、2.6%、1.7%、2.9%、4.6%、3.4%，各个组分的RSD最大为6.7%，均满足可接受标准≤10.0%，说明方法精密度良好。

2.2 实际样品分析

在验证上述UPLC-MS/MS方法在分析电子烟烟液中8种酚类化合物的可靠性和稳定性后，利用该方法对市面上常见的10种不同品牌尼古丁浓度的电子烟烟液和气溶胶样品中的对苯二酚、间苯二酚、邻苯二酚、苯酚、间/对甲苯酚、邻甲苯酚和双酚A类进行分析，数据见表7。

表7 代表性市售电子烟烟液和气溶胶中8种酚类化合物的分析测试数据

Tab.7 Analysis of 8 phenolic compounds in commercially available e-cigarette liquids and their aerosols

注：*100口各电子烟样本所消耗的烟液量分别为0.716, 0.627, 0.651, 0.709, 0.631, 0.709, 0.672, 0.666, 0.622, 和0.629 g；ND，未检出。

Note: The weight of each e-liquid sample consumed by 100 puffs is 0.716, 0.627, 0.651, 0.709, 0.631, 0.709, 0.672, 0.666, 0.622, and 0.629 g respectively; ND is short for not detected.

表7可以看出，上述测试的电子烟烟液和气溶胶样品中均为未检出有或仅含有微量的部分酚类化合物。其中苯酚和邻苯二酚相对较为常见，偶见间苯二酚和邻甲苯酚，均未检出对苯二酚和双酚A。而与这些酚类化合物的有毒剂量相比，所检测到的苯酚、间苯二酚、邻苯二酚和邻甲苯酚的浓度均远远低于安全风险限值。其中烟液和气溶胶中酚类化合物的种类和含量与电子烟烟液的口味密切相关，这表明部分酚类化合物主要来源于香精原料。部分酚类成分（如邻苯二酚）在电子烟烟液中未检出但却出现在电子烟气溶胶中，说明电子烟烟液在加热雾化的过程中可能会有酚类化合物的生成。此外，酚类化合物的其他可能来源还包括从产品包材中浸出或生产工艺过程中混入等，如苯酚。

虽然这些酚类化合物在电子烟烟液和气溶胶中的含量均较低，但此方法能进行准确的定量分析，检测限可达到 μg/g或 μg/100 puffs。表明此方法在检测电子烟烟液和气溶胶中酚类化合物应用的可靠性和准确性。

3 结论

本研究开发了一种可对电子烟烟液和气溶胶中8种酚类化合物进行系统检测分析的UPLC-MS/MS方法。该方法可在短时间内实现多种酚类物质的分离和鉴定，能排除复杂基质的干扰，具有专属性好、灵敏度高、检测限低、回收率及精密度高且快等优点。本方法成功应用于10种市场电子烟烟液和气溶胶样本的检测，分析结果显示，在测试样品中8类酚类化合物的含量多为未检出或显著低于安全剂量限值，这说明上述产品中酚类化合物的安全风险较低，对电子烟产品检测标准的建立以及检测方法的开发具有指导和借鉴意义。

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Detection of 8 phenolic compounds in E-cigarette liquids and aerosols by UPLC-MS/MS method

LUO Junjun, LIANG Jingjing, LI Xinduo, JIANG Xingtao, WU Zehong*

Relx Lab, Shenzhen RELX Tech. Co., Ltd., 518051, Shenzhen, China

[] This study aims to establish a qualitative and quantitative method for the determination of 8 potentially harmful phenolic compounds in e-cigarette liquids and aerosols, and apply it to the daily quality control of e-cigarettes. [] The e-cigarette liquid samples were firstly diluted with 50% methanol and then determined by liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS). The specificity, linearity, limit of detection and quantification, accuracy, precision, recovery rate and stability of the method were investigated. [] The suitable linear ranges of hydroquinone, bisphenol A and the remaining six phenolic compounds were 10-500 μg/mL (2= 0.994), 0.02-1.00 μg/mL (2= 0.998) and 0.2-10.0 μg/mL (2= 0.995-0.999), respectively. The relative recovery rates ranged from 80.0% to 119.2%. The maximum RSD of each component in repeatable test solution was 3.6%-6.7%; The stability of samples under different storage conditions was good. [] This method is rapid, specific, accurate and stable in detection of 8 phenolic compounds in e-cigarette liquids and aerosols.

Phenolic Compounds; UPLC-MS/MS; e-cigarette liquid; e-cigarette aerosol

. Email：cruise.wu@relxtech.com

罗君君，梁晶晶，李馨铎，等. UPLC-MS/MS法检测电子烟烟液和气溶胶中的8种酚类化合物[J]. 中国烟草学报，2022，28（5）.

LUO Junjun, LIANG Jingjing, LI Xinduo, et al. Detection of 8 phenolic compounds in E-cigarette liquids and aerosols by UPLC-MS/MS method[J]. Acta Tabacaria Sinica, 2022, 28(5).

10.16472/j.chinatobacco.2021.T0200

罗君君（1986—），本科，工程师，主要从事于新型烟草的检测分析工作，Email：lvan.luo@relxtech.com

吴泽宏（1986—），博士，副研究员，主要从事新型烟草相关研发工作，Email：cruise.wu@relxtech.com

2021-11-03；

2022-06-23