二代测序用于药品微生物检测洁净区环境菌库的建立
2022-11-10孙荣嵘徐晨刘洋任晓伟
孙荣嵘，徐晨，刘洋，任晓伟
济南市食品药品检验检测中心，济南 250102
药品的质量安全与控制关乎着人们的生命安全。近年来，药品微生物污染如“欣弗事件” “刺五加事件”等都对社会造成了重大的危害与损失。2015～2017年，美国食品药品监督管理局（FDA）公布的药品召回事件中，因微生物污染风险导致的召回占总召回事件的50%［1］。各种事件和案例都提示我们对药品微生物污染的风险控制不能大意。由于微生物的分布特点是分散的、不均一的，现行《中国药典》（2020年版）［2］规定：“供试品检出控制菌或其他致病菌时，按一次检出结果为准，不再复试。”但出于谨慎的考虑，药品微生物检验过程中的阳性结果除了样品本身的原因外，有必要排除实验室人员、环境等因素引入的污染。如果能对药品微生物检测洁净区（以下简称“洁净区”）环境微生物的群落分布及组成进行充分了解，建立洁净区的环境菌库，并对出现的污染菌进行溯源分析，可以在一定程度上有效地避免“假阳性”报告的出现，并可以制定有效的清洁消毒程序、规范检验人员在洁净区的行为等［3］，以期提高检验结果的准确性，同时还可以为生产企业的洁净环境控制提供重要的参考。
目前，利用分子生物学手段进行的微生物检测较传统的形态学及生化水平上的手工鉴定在时效性和准确性上有着较大的优势，当前实验室中采用16S rRNA测序方法已成为微生物检测的重要手段［4］。国内已有很多报道采用16S rRNA测序建立了环境菌库［3，5］。但是16S rRNA测序的缺点是其虽然在种属级别具有较高的准确度，但到了菌株级别，其区分能力会大大下降。因此，有部分研究提示该种方法在同种不同分离株内的分辨能力有限［6］，并且一些芽孢杆菌属的微生物，如枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌等存在16S rRNA序列的高度相似性，也限制了16S rRNA测序在基因分型中的应用［7］。而2020年版《中国药典》四部通则“9204 微生物鉴定指导原则”在微生物溯源分析中指出，菌株水平的鉴定在污染调查过程中非常重要［8］，并给出了全基因组测序在药品污染溯源分析中的重要指导意义。因此，本研究尝试在4个月内，周期性地从洁净区收集环境微生物并采用BBL CRYSTAL细菌鉴定仪进行生化鉴定，而后采用Miseq二代测序仪进行全基因组测序，以期获得更精确的洁净区环境微生物群落组成信息，并初步建立本实验室的环境菌库。
药品生产质量管理规范（good manufacturing practice，GMP）中要求有关药品质量控制的微生物检验必须要有验证程序［9］。因此，本研究采用实验室保存的标准菌株作为质控菌株。而本实验建立标准菌株菌库的另一原因还在于药品微生物检验的方法学验证中标准菌株的使用不可避免，因此即使不同实验室交叉污染的可能性很低，在阳性菌的溯源分析中也最好排除实验室标准菌株传入污染的可能性。因此，本研究旨在建立洁净区环境菌库的同时，建立了本实验室标准菌株菌库，为今后污染菌的溯源分析提供更全面可靠的技术支撑。
1 材料与方法
1.1 仪器与试剂
PBS 100浮游菌采样器（苏州诺达净化科技有限公司）；BX51光学显微镜（日本奥林巴斯公司）；SHP-350生化培养箱（上海精宏实验设备有限公司）；BBL CRYSTAL AutoReader细菌鉴定仪（美国BD公司）；C1000 Touch PCR仪（美国Bio-Rad公司）；QIAxcel Advanced毛细管电泳仪（德国Qiagen公司）；Qbuit 3.0核酸蛋白测定仪（美国Invitrogen公司）；Miseq二代测序仪（美国Illumina公司）。
胰酪大豆胨琼脂培养基、沙氏葡萄糖琼脂培养基、胰酪大豆胨液体培养基（北京奥博星生物科技有限公司）。试剂盒：革兰氏染色试剂盒（青岛海博生物科技有限公司）；High Pure PCR Template Preparation Kit（美国 Roche 公司）；Plant/Fungi DNA Isolation Kit（美国Sigma公司）；QIAxcel DNA Screening Kit（德国Qiagen公司）；Nextera XT Library Prep Kit、Miseq v2 Reagent Kit（美国Illumina公司）。本实验室保存的标准菌株：大肠埃希菌［CMCC(B)44102］、沙门菌［CMCC(B)50094］、铜绿假单胞菌［CMCC(B)10104］、枯草芽孢杆菌［CMCC(B)63501］、金黄色葡萄球菌［CMCC(B)26003］、白念珠菌［CMCC(F)98001］、黑曲霉［CMCC(F)98003］购自中国食品药品检定研究院；生孢梭菌［CMCC(B)64941］购自广东环凯微生物科技有限公司。
1.2 标准菌株的生化鉴定
取实验室的标准菌株大肠埃希菌、沙门菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌和生孢梭菌，划线接种到胰酪大豆胨琼脂培养基平板，于33℃培养18h后，选取相应的鉴定试剂盒，通过BBL CRYSTAL细菌鉴定仪进行种属鉴定，采用甘油冷冻法,将鉴定后的细菌连同白念珠菌、黑曲霉置于冰箱冷冻保存。
1.3 环境微生物的采集
连续4个月采用浮游菌采样器、表面接触皿、沉降菌平皿从洁净区不同区域（空气、设备、生物安全柜、墙面、地面等）采集取样。共收集细菌19株和霉菌1株。
1.4 环境微生物的生化鉴定
将采集的洁净区环境微生物进行培养、分离纯化和染色镜检后，对其进行初步分类。将纯化的细菌划线接种到胰酪大豆胨琼脂培养基平板，于33℃培养18h后，选取相应的鉴定试剂盒，通过BBL CRYSTAL细菌鉴定仪进行种属鉴定，采用甘油冷冻法，将鉴定后的细菌连同收集的环境中的霉菌置于-80℃冰箱中保存。
1.5 Miseq二代测序
1.5.1 细菌DNA提取
依据细菌基因组提取试剂盒产品说明书对6种标准菌株及收集到的环境中的19株细菌进行全基因组DNA抽提，利用Qbuit核酸蛋白测定仪检测细菌基因组DNA浓度后保存待用。
1.5.2 真菌DNA提取
依据真菌提取试剂盒产品说明书对标准菌株白念珠菌、黑曲霉及所收集的环境中的1株霉菌进行全基因组DNA提取，利用Qbuit核酸蛋白测定仪检测真菌基因组DNA浓度后保存待用。
1.5.3 建库及上机
利用DNA文库制备试剂盒进行标记基因组DNA、扩增标记后的DNA、纯化扩增后的DNA等步骤后，利用Qbuit核酸蛋白测定仪和毛细管电泳仪分别检测制备文库的浓度和片段大小分布，建库成功后进行标准化文库及混合文库。制备完成后利用Miseq二代测序仪对标准菌株及所收集的洁净区环境微生物菌株进行全基因组测序。
1.6 数据分析
利用CLC软件对测序数据进行分析，完成各菌株碱基序列的拼接，提交到美国国立生物技术信息中心（NCBI，www.ncbi.nlm.nih.gov /genbank)，选取DNA序列相似度最高的菌株结果作为比对结果。
2 结果
2.1 洁净区环境微生物和标准菌株生化鉴定结果
对收集的洁净区环境微生物菌株进行初步染色镜检，利用BBL CRYSTAL细菌鉴定仪对收集到的环境中的细菌和标准菌株（细菌）进行生化鉴定。见表1和表2。
表1 环境微生物生化鉴定结果
表2 标准菌株（细菌）生化鉴定结果
2.2 洁净区环境微生物和标准菌株的全基因组分析
采用生物信息学方法对菌株的测序结果进行数据拼接，生化鉴定结果同二代测序的结果。见表3。
表3 2种鉴定方法分析结果对比
续表
2.3 洁净区环境微生物的统计分析
对洁净区收集的环境微生物进行统计分析，革兰阳性球菌占70.0%；革兰阳性杆菌占15.0%；革兰阴性杆菌占10.0%；霉菌占5.0%。见图1。
图1 洁净区环境菌的统计分析
3 讨论
本研究从洁净区分离出的环境微生物只有20株，菌株数量不多，分析原因可能与新建实验楼洁净区启用时间不长有关。本研究洁净区分布的细菌中革兰阳性菌占绝大多数，其中又以微球菌属和葡萄球菌属为主，二者均是人体易携带污染的微生物；其次是芽孢杆菌属，为消毒剂较难消杀的一类细菌，这与大多数实验室洁净区环境微生物的类型相似［7］。这也提示我们,在日常制定洁净区的消毒规范时，应注意控制洁净区人员数量、消毒的频次和消毒剂类型的使用，以确保洁净区的环境微生物在可控范围内，不能影响药品的微生物检验工作。
从表3可以看出，藤黄微球菌和里拉微球菌用BBL CRYSTAL生代鉴定为2种菌，而二代测序鉴定结果分析均显示为藤黄微球菌。在前期对2种细菌进行革兰染氏色镜检下的形态也有一些区别，藤黄微球菌镜检下细菌的着色较深，成四连体分布，而里拉微球菌的形态较小，不成明显的四连体，提示在分类学上二者虽然同属微球菌属，却分属不同种［10］。测序通量与准确度密切相关，全基因组测序分析后的结果不一致的原因可能是二代测序的通量不够，导致准确度下降。类似的情况是生化鉴定为假生殖道棒状杆菌的菌株，二代测序为无菌水杆菌。因此，现阶段认为有必要联合运用多种手段对洁净区环境微生物进行鉴别和溯源［11］，可以大大地提高鉴定准确度，对后续相关性研究也能起到积极作用。
药品微生物检验尤其是无菌检验中，环境微生物的种类和数量是影响检验结果的重大风险因素，直接关系着检验结果的准确性和可靠性［12］。因此，建立药品检验洁净区环境微生物数据库、完善阳性检出菌溯源体系，对判断污染菌来源、实施有效的洁净环境控制非常必要［13］。全基因组测序由于有着较高的准确度和分辨率，其在药品微生物检验阳性菌的溯源分析中有着较大的应用价值和发展潜力。本研究在4个月的时间对洁净区收集的环境微生物进行收集、生化鉴定及二代测序，初步建立了近期洁净区环境菌株菌库和标准菌库，后续会不断更新和完善洁净区的环境菌库数据，动态地反映近期洁净区的环境微生物的分布情况，更好地进行环境微生物的动态监测，为药品微生物检验尤其是无菌检验的污染调查及溯源分析提供技术支持。
