HLA-DPA1基因第二外显子多态性与慢性乙型肝炎风险的相关性*

郭建峰，黄建成，陈宏斌

宁德市闽东医院检验科，福建福安 355000

乙型肝炎病毒(HBV)感染是全球重大公共卫生问题之一，人体感染HBV后可引起慢性乙型肝炎、肝硬化到肝细胞癌等一系列复杂的疾病谱[1-2]。2015年，全球约有88.7万人死于HBV感染相关疾病。我国一般人群HBV表面抗原(HBsAg)流行率为5%～6%，以此估算我国慢性HBV感染者约7 000万例[3]。人类白细胞抗原(HLA)复合体位于第6号染色体的短臂，是已知的人体最复杂的基因系统，具有高度的多态性[4-5]。HLA复合体主要包含Ⅰ类、Ⅱ类和Ⅲ类基因。其中，Ⅱ类其因包括HLA-DR、HLA-DP、HLA-DQ基因簇[6-7]。HLA-Ⅱ类分子在抗原识别和免疫应答等一系列过程中发挥了极其重要的作用，与许多感染相关疾病或肿瘤存在重要的关系，也与抗HBV感染有着密切的关系[8-9]。目前国内外学者对HLA-DRB1和HLA-DQ基因多态性与慢性HBV感染的研究较多[10-11]，而对HLA-DPA1基因多态性与慢性HBV感染的研究较少。本研究以宁德地区汉族人群为研究对象，探讨HLA-DPA1基因第二外显子多态性与慢性乙型肝炎风险的关系，以期为慢性HBV感染的分子机制提供依据。

1 资料与方法

1.1一般资料 2017年1月至2020年12月共收集到符合要求的HBV自限性感染者238例(自限性感染组)和慢性乙型肝炎患者306例(慢性乙型肝炎组)作为研究对象。研究对象的临床资料见表1。自限性感染组年龄显著高于慢性乙型肝炎组,差异有统计学意义(P<0.05)，慢性乙型肝炎组性别比例、丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天门冬氨酸氨基转移酶(AST)水平显著高于自限性感染组，差异有统计学意义(P<0.05)。研究对象的选取参照中华医学会2019年版《慢性乙型肝炎防治指南》的诊断标准[3]，慢性乙型肝炎诊断标准如下：血清HBsAg阳性至少持续6个月且血清ALT持续或反复升高,或肝组织学检查有肝炎病变。HBV自限性感染者必须为HBsAg阴性，HBV表面抗体、HBV核心抗体同时阳性，肝功能各项指标均正常。以上研究对象均排除人类免疫缺陷病毒和(或)丙型肝炎病毒感染及其他原因导致的肝脏病变者。

1.2方法

1.2.1主要试剂 DNA标志物、核酸染色剂、无水乙醇、琼脂糖和MgCl2购自生工生物工程有限公司，PCR Mix购自TaKaRa公司。DNA提取试剂盒(吸附柱法)购自天根生物科技有限公司。

1.2.2DNA提取 采集静脉血3 mL，乙二胺四乙酸抗凝，使用吸附柱法提取 DNA，过程严格按说明书操作。

1.2.3引物设计 本实验采用PCR-SSP分型技术检测HLA-DPA1第二外显子基因型，引物序列参考文献[12]，以人生长激素(HGH)为内参引物，引物由生工生物工程有限公司合成，见表2。

1.2.4PCR反应体系 分型引物上、下游(10 μmol/L)各1 μL、HGH 引物上、下游(2 μmol/L)各1 μL、MgCl2(25 mmol/mL)0.5 μL、DNA 模板(约50 μg/mL)2 μL、PCR Mix 10 μL，加去离子水至25 μL。反应条件为：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，62 ℃ 35 s，72 ℃ 30 s，10个偱环； 95 ℃ 30 s，56 ℃ 60 s，20个偱环；72 ℃ 5 min。反应结束后取20 μL产物进行琼脂糖凝胶电脉，观察扩增产物片段。

表1 研究对象的一般资料

表2 HLA-DPA1基因第二外显子等位基因扩增引物序列

2 结 果

2.1基因分型 HLA-DPA1*0202等位基因扩增结果 见图1。

2.2HLA-DPA1基因第二外显子等位基因检测结果 从表3可见，自限性感染组HLA-DPA1*0103等位基因频率为37.61%，高于慢性乙型肝炎组的29.41%，通过二元Logistic回归分析校正性别和年龄因素后，差异有统计学意义(P=0.001，OR=0.63，95%CI：0.47～0.82)。自限性感染组HLA-DPA1*0202等位基因频率为50.84%，低于慢性乙型肝炎组的60.29%，校正性别和年龄因素后，差异有统计学意义(P=0.001，OR=1.59，95%CI：1.22～2.08)。自限性感染组HLA-DPA1*0201、DPA1*0401等位基因分别为8.19%、3.36%，慢性乙型肝炎组分别为7.35%、2.94%，差异无统计学意义(P>0.05)。自限性感染组和慢性乙型肝炎组均未发现HLA-DPA1*0301和HLA-DPA1*0104等位基因。

表3 自限性感染组和慢性乙型肝炎组等位基因分布[n(%)]

3 讨 论

HBV通过肝细胞膜上的钠离子-牛磺胆酸-协同转运蛋白作为受体进入肝细胞[13]。HBV感染慢性化及发展为肝硬化和肝细胞癌的机制至今仍不清楚。多数研究认为病毒本身及环境因素不能完全解释这些差异[14-16]。LIN等[17]报道其研究人群的同卵双生子慢性HBV感染率较异卵双生子高。慢性HBV感染还具有明显的家族聚集性[18-19]，存在血缘关系的亲属较不具有血缘关系的亲属发生慢性 HBV 感染的倾向性更高[20]，上述数据提示，遗传因素是慢性 HBV 感染的重要影响原因。HLA-Ⅱ类分子具有稳定和促进免疫细胞相互结合增强免疫应答的启动和效应的功能。HLA的作用是将内源性或外源性抗原以HLA-肽复合物的形式，通过T细胞表面的TCR，传递给CD4+和CD8+T细胞，以激活T细胞产生免疫应答。2009年，KAMATANI等[21]学者通过全基因组关联分析首次报道了HLA-DPA1和HLA-DPB1基因3′端非翻译区的rs3077和rs9277535多态性与慢性乙型肝炎风险存在关联，他们进一步通过连锁分析发现，rs3077A与HLA-DPA1*0103，rs3077C与HLA-DPA1*0202存在高度连锁不平衡。在后继研究中，如YAN等[22]、WANG等[23]研究中，除了广西壮族人群研究结果无统计学意义外，其他研究人群均与KAMATANI等[21]学者的研究结果相一致。由于不同地区汉族人群遗传异质性、病毒基因型等因素的存在，我国的HBV基因型主要是B型和C型，其中南方以B型为主，北方以C型为主[3]。以上原因可能造成不同实验结果无法重复。因此，研究者认为有必要研究HLA-DPA1基因遗传变异与宁德地区汉族人群慢性乙型肝炎风险的关系。

本研究通过二元Logistic回归分析显示，HLA-DPA1*0103等位基因具有抵抗HBV感染的能力(OR=0.63)，HLA-DPA1*0202等位基因则是慢性乙型肝炎风险的危险因子(OR=1.59)。本研究与OU等[24]学者的研究结果相似。OU等[24]还发现携带rs3077 AA+GA基因型的HBV感染者其总HLA-DPA1 mRNA表达水平显著低于健康人群，同时HBV感染者HLA-DPA1*0103 mRNA的表达水平也显著低于健康人群。O′BRIEN等[25]学者发现rs3077G等位基因能降低HLA-DPA1 mRNA的表达。以上研究研究结果提示，较低的 HLA-DPA1 mRNA表达可能影响抗原肽的提呈进而降低宿主对 HBV 感染的免疫反应，导致HBV感染慢性化。

本研究还显示自限性感染组和慢性乙型肝炎组HLA-DPA1*DPA1*0103等位基因频率分别为37.61%和29.41%，与KAMATANI等[21]报道的日本健康人群和慢性乙型肝炎人群的结果(38.3%和26.8%)较为接近；本研究自限性感染组和慢性乙型肝炎组HLA-DPA1*DPA1*0202等位基因频率分别为50.84%、60.29%，均高于KAMATANI等[21]报道的日本健康人群和慢性乙型肝炎人群的结果(42.7%和53.1%)。本研究和KAMATANI等[21]研究均未发现HLA-DPA1*DPA1*0301和HLA-DPA1*DPA1*0104等位基因。

综上所述，本研究结果显示HLA-DPA1基因第二外显子多态性与慢性乙型肝炎风险存在相关性，为寻找HBV感染慢性化的分子机制提供了参考。