耐碳青霉烯类肠杆菌目细菌定植与感染临床特征及危险因素分析*

马志刚，孟雪斐，张鸿娟，单 斌△

1．昆明医科大学第一附属医院医学检验科，云南昆明 650032；2．云南省医学检验临床研究中心，云南昆明 650032；3．云南省检验医学重点实验室，云南昆明 650032；4．昭通市中医医院，云南昭通 657000

碳青霉烯类抗菌药物具有对β-内酰胺酶稳定、抗菌谱广、杀菌活性强、不良反应小等特点，被认为是临床上控制革兰阳性菌、阴性菌及厌氧菌感染最有效的抗菌药物。近年来，随着碳青霉烯类抗菌药物的广泛使用及不合理使用，对碳青霉烯类抗菌药物耐药的菌株不断被检出，其中耐碳青霉烯类肠杆菌目细菌(CRE)因增长速度快、导致的感染病死率高、敏感抗菌药物极少被认为是一个紧急的全球公共卫生安全问题[1]。CRE在胃肠道定植是继发CRE感染的高危因素，本研究通过对高危人群进行CRE的主动筛查，对主动筛查CRE定植阳性的患者进行临床资料和耐药情况分析，同时跟踪其最终的感染情况，为预防CRE感染提供依据。

1 资料与方法

1.1一般资料 收集2021年1—11月昆明医科大学第一附属医院(简称本院)3 116例中主动筛查CRE定植阳性患者的直肠拭子和对应患者感染标本中分离出的CRE菌株73株。纳入标准：入院48 h内采集直肠拭子进行CRE主动筛查阳性患者。排除标准：(1)对于多次住院，仅统计第1次筛查阳性结果；(2)对于住院期间同一患者多次筛查有两次及以上阳性结果时仅统计第1次筛查结果。根据美国疾病控制与预防中心(CDC)发布指南，患者入院48 h内、第7天及之后每隔1周采集患者直肠拭子采用碳青霉烯纸片法进行筛查，至患者出院或者死亡。CRE判断标准：参考美国CDC对CRE的定义，对亚胺培南、美罗培南、厄他培南或多利培南任一种碳青霉烯类耐药，以及针对天生或对亚胺培南敏感度降低的菌株(如摩根菌属、变形杆菌属和普罗威登菌属等)，则需根据对除亚胺培南以外的任何碳青霉烯类抗菌药物的药物敏感性试验结果判断，去除同一个患者所进行相似部位的重叠菌株。73株CRE分别来自73例不同感染情况的患者，73株CRE中有63株为耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌。根据文献[2]中医院感染诊断标准，将CRE主动筛查阳性患者73例分为发生CRE肠道外感染者31例(病例组)和未发生CRE直肠外感染者42例(对照组)。63株耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌中病例组30株、对照组33株。

1.2仪器与试剂 Vitek 2 Compact全自动细菌鉴定及药物敏感性试验分析仪购买于法国生物梅里埃公司，细菌鉴定卡、AST GN13型抗菌药物敏感性试验卡片均为法国生物梅里埃公司配套试剂，MH琼脂平板、麦康凯琼脂平板购买于郑州安图生物工程股份有限公司，美罗培南、亚胺培南、厄他培南药敏实验纸片均购自英国Oxoid公司，基质辅助激光解吸电离飞行时间(MALDI-TOF)质谱仪(德国布鲁克公司)，CO2培养箱(美国赛默飞公司)，Genesy 96TPCR扩增仪(西安天隆公司)，DYCP-31DN型电泳仪(北京六一公司)，iBright CL750凝胶成像分析仪(美国赛默飞公司)。

1.3质量控制 药物敏感性试验严格按照美国临床实验室标准化协会(CLSI)要求实施质量管理，各种技术操作按照文献[3]进行，质控菌种主要采用了大肠埃希菌ATCC25922、肺炎克雷伯菌ATCC700603、阴沟肠杆菌ATCC700323。

1.4方法

1.4.1CRE筛选方法 将直肠拭子标本均匀密涂在麦康凯平板,在平板上依次粘贴10 μg美罗培南、亚胺培南及厄他培南药敏实验纸片，经35 ℃培养18～24 h，其中任意一个纸片抑菌环直径≤18 mm初步判断为CRE，再利用MALDI-TOF质谱仪法对平板上的菌株进行识别鉴定，最后利用Vitek 2 Compact仪器法对菌株进行药物敏感性试验。用AST GN13型抗菌药物敏感性试验卡片检测菌株亚胺培南和厄他培南的最低抑菌浓度(MIC)，并用纸片扩散法贴于MH平板上，对厄他培南耐药细菌和美罗培南抑菌圈直径进行复核。药物敏感性试验研究结果，按照文献[3]的标准进行判读。药物敏感性试验结果包括了敏感 (S)、中介(I)和耐药(R)，中介并未在结果中显示。

1.4.2多位点序列分型(MLST)检测方法 根据肺炎克雷伯菌MLST 数据库(http://bigsdb.web.pasteur.fr/klebsiella/primer _used.html)提供的引物序列和反应条件，采用PCR法扩增7对管家基因(gapA、mdh、phoE、tonB、infB、pgi、rpoB)，将扩增产物的测序结果与MLST数据库进行比对，得出ST分型结果。

1.4.3临床资料收集 根据患者住院编号从医院病历系统中查询并记录其性别、年龄、住院时间、合并的基础疾病情况，留置胃管、留置尿管、机械通气、中心静脉导管，使用激素药物、质子泵抑制药物、利尿剂、精神类药物、抗真菌药物情况，是否长期卧床、腹腔引流，是否合并肿瘤，临床转归、住院次数，白细胞、血小板、清蛋白、血清肌酐水平，CRE培养及药物敏感性试验报告，非CRE多重耐药菌感染是否检出等资料，按病例组和对照组进行归类汇总。

2 结 果

2.1主动筛查CRE的结果 3 116例主动筛查CRE定植患者检出CRE 73株，检测阳性率为2.34%，其中耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌63株(30株CRE定植后感染；33株仅有CRE肠道定植)，占86.30%；耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌定植后感染率为47.6%；耐碳青霉烯大肠埃希菌8株(1株CRE定植后感染；7株仅CRE肠道定植)，占10.96%；耐碳青霉烯阴沟肠杆菌2株仅CRE肠道定植，占2.74%。CRE肠道定植后共出现病例组31株，其中14株只发生下呼吸道感染，15株同时发生下呼吸道、血液或尿路感染，2株同时下呼吸道和颅内感染；对照组42株，其中只有下呼吸道感染23株，下呼吸道合并1个或两个部位感染16株，2株无感染，1株腹腔和血液感染；两组的感染部位均以下呼吸道感染为主，其次为血液、尿路。

2.2两组一般资料比较 73例患者中男54例、女19例，年龄4～96岁、中位年龄为75.0(57.5，88.0)岁。两组中男性患者居多，病例组与对照组性别、年龄比较差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。两组患者科室分布情况：重症监护室(ICU)35例、老年呼吸二科14例、神经外科二病区8例，其他科室16例。

2.3CRE耐药情况 病例组和对照组耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌、耐碳青霉烯大肠埃希菌、耐碳青霉烯阴沟肠杆菌对多黏菌素和替加环素的敏感率均为100.0%；耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌和CRE对临床常用抗菌药物的耐药率比较见表2。病例组和对照组耐碳青霉烯肺炎克雷伯杆菌对阿米卡星的敏感率分别为23.3%、9.1%，对庆大霉素敏感率分别为20.0%、3.0%，对复方磺胺甲噁唑敏感率分别为40.0%、18.0%，差异无统计学意义(P>0.05)；对照组耐碳青霉烯大肠埃希菌(仅7株，未在表2中列出)对阿米卡星、庆大霉素、复方磺胺甲噁唑敏感率分别为37.5%、12.5%、12.5%，病例组耐碳青霉烯大肠埃希菌仅1株；对照组耐碳青霉烯阴沟肠杆菌仅2株，且未发生感染。两组耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌和耐碳青霉烯大肠埃希菌对其余的头孢菌素、β-内酰胺类药物、β-内酰胺类酶抑制剂、喹诺酮类药物、碳青霉烯类抗菌药物几乎100.0%耐药。

2.4同源性分析 MLST结果显示，病例组CRE定植后感染的30株耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌与定植感染患者的菌株配对分型，共分出ST11(23/30)和ST231(7/30)两种型，且相对应患者感染前后菌株的型别是同一型，说明两者具有高度的同源性。

表1 两组一般资料比较

2.5CRE感染危险因素分析 在病例组与对照组中，留置胃管、中心静脉导管、使用质子泵抑制药物、有多重耐药菌感染史、长期卧床、住院次数的占比比较，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表3。

表2 耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌和CRE对临床常用抗菌药物的耐药率比较[n(%)]

续表2 耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌和CRE对临床常用抗菌药物的耐药率比较[n(%)]

表3 CRE感染的单因素分析

2.6CRE感染的多因素分析 以CRE定植阳性患者是否感染了CRE为因变量，将在CRE感染单因素分析中显著差异的协变量带入多因素Logistic回归模型，结果显示中心静脉置管、使用质子泵抑制剂、有多重耐药菌感染史是CRE感染的独立危险因素(均P<0.05)，见表4。

表4 CRE感染多因素分析

3 讨 论

近些年来，CRE引起的感染形势严峻，临床治疗中其感染持续增多，分离出菌株的标本越来越多[4]。本研究中主动筛查出的CRE肠道定植以耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌为主，其次分别为耐碳青霉烯大肠埃希菌、耐碳青霉烯阴沟肠杆菌，与文献[5-6]报道结果相符。病例组中细菌检出情况同肠道定植情况都以耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌为主，标本来源和感染部位以下呼吸道感染为主，其次为血液、尿路，与多中心研究结果一致[7]。对照组感染其他细菌的标本来源和感染部位与文献[8]报道相符。但本研究中耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌占比明显高于耐碳青霉烯大肠埃希菌和耐碳青霉烯阴沟肠杆菌，可能与大部患者都有肺部感染有关，痰液中CRE检出以耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌为主[9]。也有研究报道提示痰液中分离出高毒力肺炎克雷伯菌的占比明显高于其他标本类型，其感染者年龄绝大部分在60岁以上[10-11]。因此，此次研究对象中是否有抗耐药高毒力肺炎克雷伯菌流行，有待进一步研究。

病例组和对照组感染部位均以下呼吸道感染为主，男性患者占比明显高于女性，男性是呼吸道感染易感人群，与文献[12]报道一致；本研究中CRE主动筛查阳性患者中位年龄为75岁，老年人明显占多数。随着人口老龄化寿命延长，老年人群体抵抗力差，基础疾病多，更容易引起CRE定植与感染[13]。CRE主动筛查阳性科室主要分布于ICU，阳性率明显高于其他科室，这与国内相关报道结果一致[14]。文献[15]报道住院患者同时发生多部位感染情况，ICU 是高于非ICU，感染率为35.00%，ICU患者如果发生CRE定植或感染，其他部位感染的概率也将增大。针对CRE主动筛查阳性率高的科室，易感人群应严格遵循各种操作规范诊疗，减少或杜绝易导致CRE传播的相关治疗。

本研究结果显示，CRE对临床上的常见抗菌药物呈高度耐药，对复方磺胺甲噁唑、庆大霉素、阿米卡星的耐药率稍低，与许多地区相关研究结果相似[16-17]。本研究中耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌对各种抗菌药物的耐药情况与73株CRE基本一致,对头孢类药物100.0%耐药，可能与临床长期、广泛使用碳青霉烯类药物有关。通过MLST分型结果可知定植与感染菌株具有高度同源性，主要以ST11型为主，占76.7%(23/30)，与有关研究报道的我国耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌的主要流行ST型别相符[18]。本院患者耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌定植后发生的感染率为47.6%，在院内感染监测中需高度重视由耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌引起的感染，避免院内发生集中流行情况。目前，CRE耐药机制主要包括碳青霉烯酶的产生、外膜蛋白的缺失或改变、ESBLs酶或 AmpC酶的表达、主动外排泵等，碳青霉烯酶的产生是CRE最主要的耐药机制[19]。尽管73株CRE对多黏菌素、替加环素100.0%敏感，但是由于替加环素血药浓度低，治疗某些院内获得性肺部感染疗效不确定，多黏菌素对肾脏和神经具有毒性作用，单一用药还会诱导耐药细菌产生，这些问题的存在限制了它们的使用，联合其他抗菌药物使用可以降低不良反应，降低耐药产生[20]。

临床治疗中，抗菌药物的广泛使用甚至滥用造成了许多耐药细菌和超级细菌不断产生[21]。广谱抗菌药物的长期应用易产生菌群失调，从而改变机体的正常菌群，并提高了CRE等耐药菌株定植概率。CRE定植阳性作为CRE感染的独立危险因素，在ICU中大约有50%的CRE定植患者在30 d内发展为CRE感染，与非定植患者比较，其感染率提高了10.8倍，并且CRE定植者也是潜在播散者[22]。据相关研究报道，第3代头孢菌素或氨基糖苷类治疗患者亦可能会导致CRE定植或感染[23]。因此，抗感染治疗前进行细菌鉴定和药物敏感试验，正确合理使用抗菌药物抗感染治疗显得尤为重要。中心静脉导管、留置胃管等侵袭性操是感染CRE的危险因素，其中中心静脉导管为本院独立危险因素。侵袭性操作破坏了患者生理防护屏障，利于致病病原体的侵入，提高了CRE医院传播感染的风险性。尽管中心静脉导管有好处，但它们也可能成为局部和全身血流感染的潜在入口，导致医疗系统的成本增加[24]。本研究中大部分CRE感染者有使用质子泵抑制剂的情况。有研究报道，质子泵抑制剂的使用具有导致胃肠道和肺部感染的潜在风险，包括艰难梭菌引起的感染，以及社区和医院性肺炎[25]。在CRE主动筛查阳性患者病情允许的情况下，尽量减少或缩短有创和侵入性操作，合理使用质子泵抑制剂可以有效降低CRE感染风险。

CRE定植后感染对临床常用抗菌药物产生了高度耐药性，因此治疗难度大。针对高危人群及时开展定植筛查，并积极实施综合性的感染防控措施，对于各种容易导致感染的危险因素，应尽量减少和避免，通过合理规范应用抗菌药物，才能有效防止和遏制易感群体的CRE感染和传播。