长链非编码RNA SPINT1-AS1抑制三阴性乳腺癌细胞增殖和促进凋亡的研究

刘春汕 杜坤朋 王栢耀 刘威 田允鸿

广州医科大学附属肿瘤医院放疗科（广州 510095）

2020年世界卫生组织国际癌症研究机构发布的数据显示，乳腺癌已成为全球发病率最高的癌症［1］。根据表达受体分类，乳腺癌分为Luminal A型、Luminal B 型、表皮生长因子受体-2（epidermal growth factor receptor 2，Her-2）过表达型以及TNBC 4 种类型［2-3］。在乳腺癌分型中，TNBC 是最为凶险的一种类型，其发病率大约占乳腺癌的15%～20%，生长迅速，恶性程度高。且因为TNBC 不表达雌激素受体、孕激素受体以及Her-2，因此缺乏经典的治疗靶点，目前尚无较好的针对性治疗方案［4-5］，所以探索新的治疗靶点对TNBC 是至关重要的。

lncRNA 是存在于真核生物中的一类由大于200 个核苷酸组成，以不编码蛋白为特征的RNA 分子，其具有肿瘤类型特异性［6-7］。研究表明lncRNA参与调节生物体内多种生物学过程，与人类疾病发生发展息息相关［8-9］。随着研究的深入，越来越多的证据表明多种lncRNA 可能成为TNBC 发生发展过程中关键的治疗靶点与预后生物标记物［10-12］。SPINT1-AS1 又名丝氨酸肽酶抑制剂Kunitz 1 型反义RNA 1，是位于15q15.1 染色体上，长度为632nt的lncRNA。目前对其研究较少，仅在宫颈癌、结直肠癌中报道SPINT1-AS1 高表达与不良预后有关［13-14］。但在食管鳞癌、肾母细胞癌中SPINT1-AS1 高表达与良好预后有关［15-16］。并且仅有1 篇文章报道SPINT1-AS1 在乳腺癌中促进其增殖转移［17］，该文章并没有对乳腺癌特定分子亚型进行阐述。TNBC 作为预后最差的乳腺癌亚型仍缺乏有效的治疗靶点，因此本研究拟探索lncRNA 是否可以作为TNBC 的治疗靶点。鉴于本课题组在前期的TNBC 细胞测序数据中发现SPINT1-AS1 在经典的抑癌分子miR-200c 过表达组的水平显著高于空载对照组，由此笔者猜测SPINT1-AS1 可能也具有抑癌作用。因此，本研究拟在TNBC 中探索SPINT1-AS1 的功能作用。

1 材料与方法

1.1 细胞培养MCF-10A、MDA-MB-231、BT549和MDA-MB-468 细胞均购自中国科学院细胞库，MCF-10A 使用MCF-10A 完全培养基（赛库生物公司）培养，其余细胞株使用含有10%FBS 的1640（Gibco 公司）培养，均在37 ℃含5%CO2的恒温培养箱内生长。

1.2 qRT-PCR 实验使用Trizol 裂解，氯仿提取，氯丙醇沉淀，含DEPC 水的75%酒精洗涤总RNA，将RNA 逆转录为cDNA，进行PCR 扩增。最后使用2-ΔΔCt法计算SPINT1-AS1 的表达量。

1.3 荧光原位杂交实验将MDA-MB-231与BT549细胞接种至放有细胞爬片的24 孔板中，待细胞长至80%进行实验。按照荧光原位杂交试剂盒（吉玛公司）说明书进行，PBS 清洗，4%多聚甲醛固定后PBS 清洗。0.1%Triton X-100 打孔，PBS 清洗。SPINT1-AS1 探针加入杂交缓冲液中，混匀，73 ℃变性5 min，变性结束37 ℃孵育细胞过夜。12 h 后PBS清洗，使用DAPI染细胞核，室温15 min后清洗。最后用抗荧光淬灭剂封片，共聚焦显微镜拍摄。

1.4 包装shSPINT1-AS1 病毒shSPINT1-AS1#1与shSPINT1-AS1#2 质粒由擎科生物公司合成。病毒包装质粒以及包膜蛋白质粒由中山大学附属第一医院生命科学实验室惠赠。将293T 细胞加入预先用多聚赖氨酸包被的10 cm 皿中。待细胞长至80%使用PEI 试剂转染，按照包装质粒：包膜蛋白质粒：目的基因=4∶3∶1 的比例把3 者混合。取500 μL opti-MEM 稀释混合质粒。将500 μL opti-MEM 稀释60 μg 的PEI。随后把PEI 稀释液加入混合质粒稀释液中，混匀静置15 min。随后将混合液缓缓加入293T 细胞。18 h 使用完全培养基取代含混合物的培养基，48 h 收集病毒液。收集的病毒液过滤之后可用于转染细胞。

1.5 慢病毒转染细胞实验过表达SPINT1-AS1病毒由上海和元公司合成，shSPINT1-AS1#1 与shSPINT1-AS1#2 病毒自行包装。MDA-MB-231 细胞铺至24 孔板中，待细胞长至50%时开始转染。分别使用500 μL opti-MEM 稀释10 μL 对照组以及实验组病毒液，将含1 μL/mL polybrene 的opti-MEM分别添加500 μL 至已混有病毒的对照与实验管中，混匀静置20 min。静置结束将混合液置换原来的培养基。24 h 时使用完全培养基替换混合液，随后使用嘌呤与G418 筛选得到稳定过表达与干扰SPINT1-AS1 的细胞株。

1.6 平板克隆形成实验将稳转株消化成单细胞悬液，接种于6 孔板中。细胞接种后使用完全培养基培养2 周左右终止培养。弃培养基后PBS 清洗，甲醇固定15 min后PBS清洗，结晶紫染色30 min，弃结晶紫，流水冲洗染料。最后用照相机拍摄图片。使用image J计数，GraphPad prim7.0绘制计量图。

1.7 CCK-8 检测增殖活性按日本同仁公司的CCK-8 试剂盒说明书进行实验，消化细胞接种于96孔板。分别在6、24、48、72、96 h时加入CCK-8 溶液，孵育1.5 h 后在酶标仪上450 nm 处检测OD值。最后用GraphPad Prism 7.0 绘制折线图。

1.8 Annexin V-APC/7-AAD流式细胞术测凋亡按照联科生物凋亡试剂盒对细胞进行染色、孵育、过滤细胞团块处理，随后使用流式细胞仪检测。最后使用Flow jo 软件分析流式凋亡数据，Graph-Pad prim7.0 绘制凋亡计量图。

1.9 统计学方法使用GraphPad Prism 7.0 软件分析数据。计数数据以（）表示，组间比较采用单因素方差分析；配对样本比较采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SPINT1-AS1 在正常乳腺上皮细胞及3 种TNBC 细胞中的表达为了研究SPINT1-AS1 在乳腺癌中的作用，本实验首先比较其在正常乳腺上皮细胞以及TNBC 细胞中的表达情况。结果显示，与正常乳腺上皮细胞MCF-10A 相比，在TNBC 细胞系MDA-MB-231、BT549 和MDA-MB-468 的SPINT1-AS1 的表达量均明显降低（MDA-MB-468：t= 134.90，MDA-MB-231：t= 2 171.00，BT549：t=18 938.00，P＜0.000 1，图1）。结果提示，SPINT1-AS1 可能在抑制TNBC 发生发展中起着重要作用。

图1 qRT-PCR 检测SPINT1-AS1 在细胞株间的表达Fig.1 qRT-PCR detects the expression of SPINT1-AS1 in various cell lines

2.2 SPINT1-AS1 在TNBC 细胞株的定位既往研究显示，lncRNA 的功能与其表达位置存在相关性。为了研究lncRNA 的可能机制，本课题首先检测了SPINT1-AS1 的细胞定位。见图2，使用共聚焦显微镜探索SPINT1-AS1 在MDA-MB-231 以及BT549 细胞中的定位，发现SPINT1-AS1 主要表达于细胞质。说明SPINT1-AS1 作为一个lncRNA，主要是以转录后调控方式作用于细胞，具体调控机制有待进一步研究。

图2 SPINT1-AS1 在MDA-MB-231 与BT549 细胞株的定位Fig.2 The localization of SPINT1-AS1 in MDA-MB-231 and BT549 cell lines

2.3 SPINT1-AS1 对TNBC 细胞增殖活性的影响为了研究SPINT1-AS1 对乳腺癌细胞株的影响，本实验首先检测SPINT1-AS1 不同表达水平细胞株之间的增殖能力差异。在MDA-MB-231 与BT549 细胞中过表达SPINT1-AS1，能显著降低细胞克隆形成能力（MDA-MB-231：t= 64.00，BT549：t= 10.74，P＜0.01，图3A）。在MDA-MB-231 细胞敲减SPINT1-AS1 后，与对照组相比，实验组的克隆形成能力明显增强（shSPINT1-AS1#1：t= 11.43，shSPINT1-AS1#2：t= 10.01，P＜0.01，图3B）。进一步使用CCK-8 检测SPINT1-AS1 对TNBC 增殖活性的影响。在MDA-MB-231 与BT549 细胞过表达SPINT1-AS1，能显著降低细胞增殖能力（MDA-MB-231：96 h，t= 3.63，BT549：96 h，t= 4.30，P＜0.05，图3C）。在MDA-MB-231 细胞干扰SPINT1-AS1 后，与对照组相比，增殖能力明显增强（shSPINT1-AS1#1：t= 3.28，shSPINT1-AS1#2：t= 4.29，P＜0.05，图3D）。总之，上述结果提示SPINT1-AS1 抑制TNBC细胞增殖。

图3 过表达与敲低SPINT1-AS1 对TNBC 细胞株增殖的影响Fig.3 Effects of overexpression and knock-down of SPINT1-AS1 on the proliferation of TNBC cell lines

2.4 SPINT1-AS1 对TNBC 细胞凋亡的影响使用流式细胞仪检测细胞凋亡，当在TNBC 细胞系中过表达SPINT1-AS1 时，实验组细胞的总凋亡率（早期凋亡率+晚期凋亡率）高于对照组，在BT549细胞中表现尤为明显（MDA-MB-231：t= 5.24，BT549：t= 10.19，P＜0.05，图4A）。然而，当敲低SPINT1-AS1 时，实验组的总凋亡率低于对照组（shSPINT1-AS1#1：t= 6.28，shSPINT1-AS1#2：t=9.70，P＜0.05，图4B）。上述结果提示SPINT1-AS1能促进TNBC 凋亡。

图4 过表达与敲低SPINT1-AS1 对TNBC 细胞株凋亡的影响Fig.4 Effects of overexpression and knock-down of SPINT1-AS1 on the apoptosis of TNBC cell lines

3 讨论

乳腺癌是全球女性最常见的癌症、也是导致死亡的重要原因之一［18-19］。与非TNBC 相比，TNBC具有高度异质性和更强侵袭性，因为其不表达雌激素受体、孕激素受体、Her-2 等标志物，所以目前缺乏靶向治疗TNBC 的方法［20］。因此，探究针对TNBC 的新治疗靶点尤为重要。既往研究显示，lncRNA 可以参与调控TNBC 细胞增殖、凋亡、转移等病理生理过程［21］。因此lncRNA 成为治疗TNBC的潜在靶标。本实验研究了lncRNA SPINT1-AS1在TNBC 中的作用，结果显示SPINT1-AS1 能抑制TNBC 细胞增殖以及促进其凋亡。

SPINT1-AS1 是一种lncRNA。目前研究发现SPINT1-AS1 在不同癌症发挥不同的功能，研究证明［13］SPINT1-AS1 抑制miR-214 进而激活Wnt/β-连环蛋白信号从而驱动宫颈癌细胞增殖、迁移和侵袭，验证SPINT1-AS1 水平升高与宫颈癌患者预后不良有关。LI 等［14］在结直肠癌中发现SPINT1-AS1在癌组织的表达明显高于癌旁组织，且发现高SPNT1-AS1 表达患者更易发生远处转移以及无复发生存期显著缩短。然而，在食管鳞癌中SPINT1-AS1 的表达与癌旁组织相比明显下调，并且通过生存曲线分析发现SPINT1-AS1 表达高的患者总体生存期更长［15］。同样在一项透明细胞肾母细胞癌的研究中作者从数据库筛选出9 个差异表达lncRNA，SPINT1-AS1 就是其中之一，通过LASSO运算、COX 回归与生存分析得出SPINT1-AS1 表达高的患者预后更好的结论［16］。因此，在食管鳞癌、肾母细胞癌中高表达的SPINT1-AS1 与预后良好有关。不仅如此，高水平的SPINT1-AS1 可能使胃癌细胞NCL-N87 与乳腺癌细胞MCF-7 对拉帕替尼治疗更敏感［22］。上述截然不同的研究结果证明SPINT1-AS1 所发挥功能是具有癌症特异性的。在乳腺癌中，虽然ZHOU 等［17］已发表的研究中表明SPINT1-AS1 具有促进乳腺癌细胞增殖、迁移的作用。但本实验通过qRT-PCR 检测发现在乳腺正常细胞中SPINT1-AS1 的表达水平高于TNBC 细胞；进一步通过转染病毒建立过表达与敲低SPINT1-AS1 稳转株，当SPINT1-AS1 水平增加时，TNBC 细胞增殖能力显著下降，凋亡显著增加。当敲低SPINT1-AS1 时作用相反。总之，本研究通过一系列实验发现SPINT1-AS1 可以显著抑制TNBC 细胞的增殖并促进其凋亡。虽然本研究的结论与周等人的部分研究结论相反，但这可能与两个研究采用不同的SPINT1-AS1 转录本有关。本研究是针对SPINT1-AS1 的第2 个转录本NR_146467.1 进行研究，而周的研究并未明确指出使用具体的转录本，这证明SPINT1-AS1 不仅具有肿瘤特异性，而且还可能具有转录本特异性。作为调控基因转录的lncRNA，SPINT1-AS1 可能通过不同的下游靶点来发挥不同的生物学效应。因此，SPINT1-AS1 在TNBC 的发生发展中的作用仍需要全方位、多维度、多组学的探索。已有许多研究报道［12］lncRNA在TNBC 的发生发展中发挥重要作用，例如lncRNA MIR503HG 抑制TNBC 细胞增殖以及促进其凋亡，作者从全方位、多维度，多组学验证了MIR503HG通过miR-224-5p/HOXA9 轴抑制细胞增殖并促进TNBC 细胞凋亡。与本研究相同的是作者同样使用CCK-8、克隆形成、流式细胞术检测细胞增殖与凋亡，但作者不局限于此，不仅验证了MIR503HG在体内同样发挥抑癌功能，而且进一步通过生信分析、双荧光素酶报告基因实验等探索了lncRNA的下游机制，这是本实验所缺少的，有待本课题组进一步完善。总之，本研究结果证明了SPINT1-AS1 能够抑制TNBC 细胞的增殖并促进其凋亡。并且本研究确认了SPINT1-AS1 主要表达于TNBC细胞的细胞质，极大可能是通过转录后途径参与细胞发生发展。

综上所述，本实验证实了SPINT1-AS1 抑制TNBC 细胞增殖以及促进其凋亡。当然，本研究还存在一些不足。首先本研究缺乏体内实验来验证SPINT1-AS1 对肿瘤生长、凋亡的作用，其次我们对SPINT1-AS1 在TNBC 细胞的抑癌作用的具体作用机制仍未阐明，我们初步的机制研究结果提示，SPINT1-AS1 主要定位于细胞质，极大可能是通过转录后途径参与细胞发生发展。尽管仍需要通过测序或生信分析等方法进一步完善对SPINT1-AS1下游机制的探索，但是这样的结果已经给出了重要的提示，SPINT1-AS1 可能成为治疗TNBC 的一个新靶点，这为临床治疗TNBC 提供新方向。因此在今后的研究中，将继续深入探索SPINT1-AS1 在TNBC 的作用机制。