补益肝肾汤对小鼠骨关节炎模型的影响及其机制

彭福 刘洋 孙权 袁云飞 郑明慧 胡高源 唐东昕 徐远坤

1贵州中医药大学骨伤学院（贵阳 550001）；2贵州中医药大学第一附属医院骨伤科（贵阳 550001）

骨关节炎（osteoarthritis，OA）是一种常见的退行性疾病，与年龄、肥胖、性别、体质量和外伤有关［1］。主要表现是滑膜增生，骨赘形成，软骨下骨硬化，进行性关节软骨破坏，细胞外基质合成和分解代谢失衡导致软骨丢失［2］。据统计，OA 影响着全球2.5 亿人口的生活，每年带来超过891 亿美元的经济负担［3］。目前，早期和中期OA 的治疗策略是缓解关节疼痛和关节内注射，晚期OA 的治疗策略是关节置换手术。然而，这些治疗虽能在一定程度上缓解OA 的症状，提高患者的生存质量，但对阻断OA 的进行性发展作用甚微。OA 的具体发病机制尚未明确。现有证据表明，OA 的发病机制与炎症因子、cho淋巴细胞异常凋亡、细胞外基质降解有关。OA 发展过程中，肿瘤坏死因子（TNF-α）、IL-1、IL-6 等炎性因子异常表达，导致软骨细胞凋亡增加，细胞外基质降解［1，4］。目前，OA 的早期诊断和治疗仍缺乏有效的手段。

中医药治疗骨关节炎的疗效确切，具有疗效好、副作用小的优势，显示了良好的应用前景［5］。骨关节炎是一种关节退行性病变，与肝肾关系密切。目前，补益肝肾在治疗骨关节炎上起着重要作用［5］。中医药治疗骨关节炎可谓是百家争鸣、百花齐放。无论是从专病专方还是从中药制剂均在临床中取得了显著的进展，为中医药治疗痹病提供了新的思路［6］。近年来，中医药在骨关节炎的研究取得了很大的进展，中医药可以通过促进软骨细胞增殖、抑制软骨细胞凋亡、抑制炎性因子释放、改善氧自由基的异常代谢、抑制NO 合成、下调基质金属蛋白酶（MMPs）水平等多个环节来恢复关节软骨的代谢平衡［5］，这些理论为中医药临床治疗本病提供了大量的理论依据。

补益肝肾中药内服法治疗骨关节炎患者在改善膝关节症状及膝关节关功能，延缓早期关节软骨的退化，抗炎、保护和修复关节软骨方面具有确切证据和临床验证。中医药由于具有整体调节、多靶点作用等优点，使得从中医药角度防治OA 成为研究热点。

1 材料与方法

1.1 实验动物C57bl/6j 小鼠57 只，雄性，6～8 周龄，湖南斯莱克景达实验动物有限公司。饲养条件：温度18～26 ℃，湿度：30%～70%。伦理许可证号：SCXK（湘）2019-0004。

1.2 实验试剂自噬抑制剂雷帕霉素：源叶生物（CAS：53123-88-9）；TGF-B1（bs-0086R，Bioss）；ALK5（bs-0638R，Bioss）；smad3（af6362，Affinity）；smad2（bs-0718R，Bioss）；SOX9（bs-4117R，Bioss）；P70S6K（14484-1-ap，Proteintech）；PI3K（21739-1-AP，Proteintech）；AKT（ab8805，abcam）；MTOR（66888-1-Ig，Proteintech）；小鼠白细胞介素6（IL-6）ELISA 试剂盒（ED-20188，昌仑硕）；小鼠白细胞介素8（IL-8）试剂盒（ED-20191，昌仑硕）；小鼠肿瘤坏死因子α（TNF-α）试剂盒（ED-20852，昌仑硕）；Rabbit Anti TGF-β 1（bs-0086R，Bioss，1/1 000）；Rabbit Anti ALK5（bs-0638R，Bioss，1/500）；Rabbit Anti Sox9（bs-4177R，Bioss，1/500）；Rabbit Anti PI3K（AF6241，Affinity，1/1 000）；Rabbit Anti AKT（AF4718，Affinity，1/1 000）。

1.3 药物配制补益肝肾汤高剂量：将126 g 生药，补益肝肾复方：独活9 g，桑寄生9 g，杜仲9 g，牛膝9 g，细辛9 g，秦艽9 g，茯苓9 g，肉桂心9 g，防风9 g，川芎9 g，人参9 g，甘草9 g，当归6 g，芍药6 g，干地黄6 g。放入纯水，水量浸没过中药，浸泡1 h，然后开始煎煮2 h，收集药水，再次加水煎煮2 h 得到中药和第一次中药混合浓缩得到5 g/mL的浓度100 mL，高剂量小鼠给药体积为0.15 mL/10 g，中剂量小鼠给药体积为0.075 mL/10 g，低剂量小鼠给药体积为0.037 5 mL/10 g。

1.4 小鼠前交叉韧带切断造骨关节炎的模型建立小鼠称重后按1%戊巴比妥钠腹腔注射（剂量150 mg/kg）。将完全麻醉的小鼠剃去膝关节处鼠毛并消毒皮肤。暴露膝关节滑车沟：于膝关节处用手术刀做一平滑切口，钝性分小鼠皮肤肌肉，暴露膝关节，靠近膝关节处再次开口切口肌肉，把肌肉向对侧翻转，暴露膝关节滑车沟。暴露前交叉韧带：用显微镊子小心分离关节腔脂肪垫，将小鼠膝关节弯曲到90°，暴露前交叉韧带。通过抽屉实验验证造模效果。术后护理：缝合皮肤消毒。将小鼠转移至电热毯上，做好保暖措施，待小鼠完全苏醒后转移至干净鼠笼中。

1.5 实验分组及给药处理（1）对照组（Control）；（2）模型组（KOA）；（3）模型+补益肝肾汤低剂量给药组（0.037 5 mL/10 g）；（4）模型+补益肝肾汤中剂量给药组（0.075 mL/10 g）；（5）模型+补益肝肾汤高剂量给药组（0.15 mL/10 g）；造模1 个月后进行1 次/d 灌胃补益肝肾汤连续30 d，高剂量给药体积为0.15 mL/10 g，中剂量小鼠给药体积为0.075 mL/10 g，低剂量小鼠给药体积为0.037 5 mL/10 g。

1.6 番红O 染色参照戴方骏等［7］的方法对各组软骨组织进行番红O 染色，观察软骨下的骨组织结构。

1.7 免疫组化参照曾澄等［8］方法对各组软骨组织进行免疫组化染色，观察GF-B1：200；ALK5（1∶200）；smad2（1∶200）；smad3（1∶100）；SOX9（1∶200）；P70S6K（1∶200）；PI3K（1∶100）；AKT（1∶200）mtor（1∶50）的表达水平。

1.8 Western blot参照吕昌伟等［9］方法检测TGF-β1、ALK5、Sox9、PI3K、AKT 的蛋白水平。

1.9 HE 染色参照曾澄等［8］描述的方法对各组软骨组织进行HE 染色。

1.10 ELISA 检测参照ELISA 试剂盒，检测各组外周血中TNF-α、IL-6、IL-8 的表达水平。

1.11 统计学方法应用SPSS 20.0 软件进行统计分析。结果采用均数±标准差表示，两组之间定量数值比较采用独立样本t检验，多组之间定量数值比较采用单因素方差分析，两两比较采用S-N-K法。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 KOA 模型验证正常组软骨表面光滑、红色软骨层次明显，模型组红染少软骨明显减少，软骨表面不光滑被纤维组织取代，模型成功。见图1。

图1 番红O 染色验证造模Fig.1 Safranin O staining to verify the modeling

2.2 KOA 模型小鼠软骨组织中各蛋白表达变化免疫组化结果显示，相较于对照组，模型组小鼠软骨组织中TGF-β1、ALK5、smad2、smad3、Sox9、p70S6K、PI3K、AKT、mTOR 的表达水平有所降低，见图2A。相较于对照组，模型组小鼠软骨组织中TGF-β1、ALK5、Sox9、PI3K、AKT 的蛋白表达显著下调（P＜0.05），见图2B。

图2 KOA 模型小鼠软骨组织中各蛋白表达变化Fig.2 Changes of protein expression in cartilage tissue of KOA model mice

2.3 不同剂量补益肝肾汤对小鼠骨关节炎的影响免疫组化结果显示，相较于对照组，模型组小鼠软骨组织中TGF-β1、ALK5、smad2、smad3、Sox9、p70S6K、PI3K、AKT、mTOR 的表达发生显著下调（P＜0.05）；而补益肝肾汤治疗组小鼠软骨组织相较于模型组小鼠软骨组织，TGF-β1、ALK5、smad2、smad3、Sox9、p70S6K、PI3K、AKT、mTOR 的表达发生显著上调（P＜0.05），且这种上调趋势随着补益肝肾汤的浓度上升而上升，见图3A。相较于对照组，模型组小鼠外周血TNF-α、IL-6、IL-8 的表达显著上调（P＜0.05）；而补益肝肾汤治疗后相较于模型组，TNF-α、IL-6、IL-8的表达显著下调（P＜0.05），且这种上调趋势随着补益肝肾汤的浓度上升而上升，见图3B。

图3 不同剂量补益肝肾汤对小鼠骨关节炎的影响Fig.3 Effects of different doses of Buyiganshen decoction on osteoarthritis in mice

2.4 补益肝肾汤介导TGF-β1 信号通路对小鼠骨关节炎模型的影响相较于骨关节炎模型组，补益肝肾汤治疗组小鼠软骨组织退变程度减弱、炎性细胞浸润数目减少、嗜复红蛋白沉积减轻，见图4A。而补益肝肾汤治疗组在添加TGF-β1 抑制剂SB-431542 组后相较于补益肝肾汤治疗组，小鼠软骨组织退变程度增强、炎性细胞浸润数目增多、嗜复红蛋白沉积增多。相较于骨关节炎模型组，补益肝肾汤治疗组小鼠软骨组织中TGF-β1、ALK5、smad2、smad3、Sox9、p70S6K、PI3K、AKT、mTOR 的表达发生显著上调；而补益肝肾汤治疗组添加TGF-β1 抑制剂SB-431542 组后相较于补益肝肾汤治疗组的TGF-β1、ALK5、smad2、smad3、Sox9、p70S6K、PI3K、AKT、mTOR 的表达发生显著下调，见图4B。相较于骨关节炎模型组，补益肝肾汤治疗组小鼠软骨组织中TNF-α 的表达显著下调（P＜0.05），而在分别添加TGF-β1 抑制剂后，这一下调趋势被显著逆转，且相较于补益肝肾汤治疗组TNF-α 的表达发生显著上调（P＜0.05），见图4C。

图4 补益肝肾汤介导TGF-β1 信号通路对小鼠骨关节炎模型的影响Fig.4 The effect of Buyiganshen decoction mediated TGF-β1 signaling pathway on mouse osteoarthritis model

3 讨论

本研究主要通过切断前交叉韧带法以建立KOA 小鼠模型。膝关节炎的造模方法主要有关节内手术（Hulth 法、前交叉韧带切断法、半月板切除法、软骨缺损法、破坏关节稳定术、破坏关节血液循环术），非手术方法（关节制动、寒冷刺激、关节撞击）；关节腔内注射药物法（尿激酶型纤溶酶原激活物、木瓜蛋白酶、胶原蛋白酶等）［6，10］。通过番红O 染色发现，正常组软骨表面光滑、红色软骨层次明显，模型组红染少软骨明显减少，软骨表面不光滑被纤维组织取代，说明KOA 模型成功。

TGF-β1 是由TUCKER 最早发现的一种多功能细胞因子，在胚胎发育、细胞增殖与分化、细胞凋亡、免疫调节、血管生成、炎性反应、组织修复、纤维化等多个方面都有重要作用［11］，TGF-β1 信号传导通路异常与多种疾病的发生、发展密切相关［12］。ALK5 的活化是激活Smad2 和smad3 分子磷酸化激活过程的关键［13］。TGF-β1 通过β-catenin信号通路［14］促进软骨细胞增殖并维持软骨细胞表型。这一过程的完成通过Smad3 激活而增强了II型胶原的合成，SOX9 与Smad2 和Smad4 结合形成的复杂复合物激活了Smad3［15］。这个Smad2/3 信号通路能够抑制体外培养软骨细胞的成熟和肥大性分化。Smad3 基因缺乏小鼠会发生软骨退变性疾病，而Smad3 基因缺失小鼠合并TGF-β1 分子病变的话将会导致骨关节炎的发生［16-17］。TGF-β1 参与的分子信号通路较多，抑制软骨细胞衰老、维持软骨细胞表型的主要通路有TGF-β1-ALK5-Smad2，3-Sox9 通路，TGF-β1-PI3-Akt-mTor-p70S6 通路，这些通路激活和上调的终末效应都是促进Ⅱ型胶原分泌，促进多糖蛋白形成［18-19］。而Ⅱ型胶原和多糖的分泌正是软骨细胞和软骨组织生物活性维持的关键。本研究结果表明，KOA 模型小鼠软骨组织中TGF-β1、ALK5、Smad2、Smad3、Sox9、p70S6K、PI3K、AKT、mTOR 的表达水平有所降低。这结果说明在OA 关节软骨细胞退变、破坏过程中，TGFβ1-SOX9/p70S6-细胞外基质信号通路的调节具有重要作用。

中药在治疗关节炎上也有很大的进展。陶娟［20］观察补益肝肾法治疗骨关节炎的疗效，治疗组采用补益肝肾中药治疗骨关节炎患者30 例，并与美洛昔康组做对照，总有效率分别为86%和83%。所以在本研究中进一步探究补益肝肾汤发挥骨关节炎治疗的具体机制，结果发现，小鼠软骨组织退变程度减弱、炎性细胞浸润数目减少、嗜复红蛋白沉积减轻；小鼠软骨组织中TGF-β1、ALK5、Smad2、Smad3、Sox9、p70S6K、PI3K、AKT、mTOR 的表达发生显著上调；而这些结果可以被TGF-β1抑制剂逆转。这些结果说明补益肝肾汤对骨关节炎具有治疗作用，并且这种作用是通过TGFβ1-SOX9/p70S6-细胞外基质信号通路起作用。

IL-6 可抑制骨糖蛋白合成，并促进成纤维细胞和基质微分子的降解，从而加重软骨损伤［21］。IL-8 是目前已知作用最强的中性粒细胞趋化因子，可由滑膜细胞本身分泌，促使炎症细胞向炎症部位募集，增强对关节软骨的损伤作用［22-23］。抑制滑膜细胞中IL-8 表达有可能成为延缓OA 发病进程的关键因素。TNF-α 可通过降解软骨基质、提高其他炎性因子活性、促进骨膜细胞产生前列腺素E2 等多个方面破坏膝关节软骨组织［24-25］。本研究结果显示，KOA 组的TNF-α、IL-6、IL-8 表达均升高，用补益肝肾汤治疗后TNF-α、IL-6、IL-8 表达均下降；而这些结果可以被TGF-β1 抑制剂逆转。说明补益肝肾汤可抑膝关节OA 小鼠滑膜细胞炎性因子分泌；而这种作用是通过TGFβ1-SOX9/p70S6-细胞外基质信号通路起作用。

综上所述，在OA 关节软骨细胞退变、破坏过程中，TGFβ1-SOX9/p70S6-细胞外基质信号通路的调节具有重要作用，并且补益肝肾中药复方可以通过激活TGFβ1-SOX9/p70S6-细胞外基质信号通路从而治疗OA，后续可以通过药物成分的分析，通路回溯验证实验以及药物单体研究等进行进一步研究。