穴位电刺激对卒中后大鼠认知功能及氧化应激水平影响

马伊笛，孙晓伟，胡晓阳△

(1.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040；2.黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨 150040)

脑卒中是一种以血管阻塞为特征的神经系统疾病，是全球第二大死亡诱因，每年可造成约 550 万人死亡[1]。近年来，我国脑卒中发病率持续上升，已成为我国成年人群死亡和伤残的首位病因[2]。相关研究显示，临床60%以上的脑卒中患者会表现出不同程度的认知功能障碍，严重影响患者机体功能恢复及日常生活质量，也为患者家庭及社会带来了不可忽视的负担[3]。目前，针对卒中后认知功能障碍(Post stroke cognitive impairment，PSCI)尚无特异性治疗药物，临床常用药物如胆碱酯酶抑制剂、钙通道阻滞剂等仅有一些改善作用。针刺作为传统中医治疗手段之一，目前已广泛应用于脑卒中及相关疾病的恢复期治疗且治疗效果良好。大量临床观察研究表明，针刺可对PSCI起到良好治疗作用，但其起效机制尚未明确，仍需深入研究。本研究通过建立大鼠大脑中动脉缺血(MCAO)模型，观察电刺激百会穴、神庭穴对模型大鼠认知功能与氧化应激水平的影响，并探究其作用机制与PI3k/Akt信号通路的联系，以期为穴位电刺激治疗卒中后认知功能障碍的相关研究与临床应用提供参考。

1 实验材料

1.1 实验动物

36只健康SPF级雄性SD大鼠，体质量(180～220) g，来源为黑龙江中医药大学动物实验中心，许可证编号：SCXK(黑)2018-001。大鼠饲养于恒温(22～25 ℃)、恒湿(65%～70%)、自然采光和自由饮水，严格遵循《动物实验管理条例》要求。

1.2 试剂及仪器

1.2.1 仪器 Super Maze Morris 水迷宫视频分析系统(XR-XM101，上海欣软信息技术有限公司)；华佗电子针疗仪(SDZ-Ⅱ型，苏州医疗用品厂有限公司)；台式冷冻离心机(德国Biofugestratos)；涡旋混匀仪[(Vortex)QL-901，海门市其林贝尔仪器制造有限公司]；酶标仪(美国VersaMax)；大脑中动脉阻塞模型线栓(MSRC43B260PK50，深圳市瑞沃德生命科技有限公司)；无菌针灸针(环球牌，苏州针灸用品有限公司，规格：0.30 mm×25 mm)；非吸收性外科缝线(3-0)(扬州市华翔医疗器械厂有限公司)；LEICA819一次性窄刀片(德国徕卡LEICA)。

1.2.2 试剂 SOD试剂盒(上海邦奕DRE20008);MDA试剂盒(上海谷研GOY-E2484);Anti-FLK-1、P13K及phospho-Akt(Ser473)(美国CST公司)；总RNA提取试剂(trizol Ta Ka Ra公司)；RT-PCR技术盒(Ta Ka Ra公司)；PCR Mix(重庆升博生物科技有限公司)。

2 实验方法

2.1 模型建立及分组方法

将36只雄性SD大鼠适应性喂养1周，随机选取10只大鼠作为假手术组，切开颈部皮肤，分离颈总动脉、颈内动脉与颈外动脉后消毒切口，缝合皮肤。其余26只大鼠采用Longa线栓法进行造模[4]。以2%戊巴比妥钠溶液对大鼠进行腹腔注射麻醉，给药量为50 mg/kg。麻醉后剪开大鼠左侧颈部，钝性分离肌群，游离颈总动脉、颈内动脉与颈外动脉。结扎颈总动脉近心端和颈外动脉，夹闭颈内动脉远端。于颈总动脉附近1 cm处切口，插入尼龙线至颈内动脉，深度约20 mm。完成线栓插入后扎紧动脉残端，消毒后进行常规缝合。大鼠清醒后单笼饲养，并参考Longa神经功能评价方法对术后大鼠进行神经功能评分。评分方法：无明显神经功能缺失表现(0分)；提尾时左侧前肢屈曲且不能伸展(1分)；爬行时出现追尾表现或向左侧划圈(2分)；爬行困难，向左侧倾倒(3分)；意识丧失，不能爬行(4分)。选取1～3分大鼠为成功模型，剔除0分与4分大鼠。假手术组无死亡，手术组20只大鼠造模成功，随机分为模型组与治疗组，每组10只。

2.2 干预方式

2.2.1 电针组 造模1 d后开始干预。采用电针干预百会穴、神庭穴，腧穴定位参考《实验针灸学》《实验动物常用穴位名称与定位》确定百会穴、神庭穴位置[5-6]。选用直径0.3 mm无菌针灸针以30 °斜刺入皮肤，针刺深度约2 mm。进针后连接电针仪，设置疏密波，电压峰值6 V，频率1/20 Hz，以针体轻抖且动物耐受为得气，持续治疗20 min。治疗频率1次/d，连续治疗14 d。

2.2.2 模型组和假手术组 除每日同时间抓取固定30 min外，不给予任何干预措施。

2.3 指标检测与观察方法

2.3.1 Morris水迷宫实验 于治疗14 d后开展Morris水迷宫实验。采用大鼠通用型圆形水迷宫装置，水池尺寸120 cm×60 cm，设置水深25 cm，水温23 ℃。水池分为4个象限，于第3象限中心放置圆形平台，平台尺寸为高23 cm、直径10 cm。将大鼠面向池壁随机放入1个象限，计时60 s，记录其找到平台时间(即逃避潜伏期)。超过60 s未找到平台，则视为逃避潜伏期60 s。训练频率2次/d，每次间隔20 min，持续训练5 d。第6天将平台撤走，将大鼠于原先象限对侧放入水池，记录大鼠逃避潜伏期及目标象限停留时间与穿越原平台次数。

2.3.2 组织取材 Morris水迷宫行为学测试结束后，颈椎脱臼处死大鼠后断头取出完整脑组织。预冷PBS冲洗后，每组取5份脑组织用滤纸吸干，用于脑组织含水量检测；3份脑组织按1：9重量体积比例加入PBS匀浆后以5 000 r/min离心10 min，取上清液转移至EP管中-80℃贮存，用于SOD、MDA含量检测；两份脑组织置于EP管中液氮保存，用于PI3k、Akt mRNA检测。

2.3.3 脑组织含水量检测 滤纸吸干后天平称取脑组织湿重，称量完毕后将脑组织置于110 ℃恒温干燥箱中干燥，48 h后称重，记为脑组织干重。全部称量完毕后计算脑组织含水量。脑组织含水量(%)=(湿重-干重)/湿重×100%。

2.3.4 脑组织SOD、MDA含量检测 取-80 ℃保存的上清液于恒温水浴锅中复温。复温后，根据试剂盒要求依次添加已配置好的试剂，添加结束后充分混匀。采用多功能酶标仪于450 nm波长处进行检测。

2.3.5 脑组织PI3k、Akt mRNA相对表达水平检测 取液氮中保存的脑组织，Trizol法提取总RNA后进行反转录。荧光定量PCR测定PI3K及Akt mRNA的相对表达量。反应条件为：95 ℃预变性1 min,95 ℃变性5 s,60 ℃退火10 s，40次循环。以GAPDH为内参，按照2-△△Ct法分析PI3k及Akt mRNA相对表达水平。引物序列见表1。

表1 PI3k、Akt mRNA引物序列

2.4 统计学处理

3 结果

3.1 各组认知功能比较

Morris水迷宫实验结果显示，与假手术组比较，模型组逃避潜伏期显著延长，差异具有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，治疗组逃避潜伏期有所缩短，差异具有统计学意义(P<0.05)。与假手术组比较，模型组目标象限停留时间及穿越原平台次数均降低，差异具有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，治疗组目标象限停留时间及穿越原平台次数有所增多，差异具有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 各组大鼠认知功能比较

3.2 各组脑组织含水量比较

对比3组大鼠脑组织含水量，发现与假手术组比较，模型组脑组织含水量显著升高，差异具有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，治疗组脑组织含水量显著降低，差异具有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 各组大鼠脑组织含水量

3.3 各组脑组织SOD、MDA含量比较

对比3组大鼠脑组织SOD及MDA水平发现，与假手术比较，模型组脑组织SOD含量显著降低，差异具有统计学意义(P<0.05)，MDA含量显著升高，差异具有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，治疗组脑组织SOD含量显著增高，差异具有统计学意义(P<0.05)，MDA含量显著降低，差异具有统计学意义(P<0.05)。见表4。

表4 各组大鼠脑组织SOD、MDA含量

3.4 各组脑组织PI3k、Akt mRNA相对表达水平比较

对比3组大鼠脑组织PI3k、Akt mRNA相对表达水平发现与假手术组比较，模型组脑组织PI3k、Akt mRNA相对表达水平显著升高，差异具有统计学意义(P<0.05)，与模型组比较，治疗组PI3k、Akt mRNA相对表达水平显著升高，差异具有统计学意义(P<0.05)。见表5、图1。

表5 各组大鼠脑组织PI3k、Akt mRNA相对表达水平

注：图中曲线从右到左依次为假手术组、模型组和治疗组。

4 讨论

PSCI被认为是脑卒中主要并发症之一，目前，我国已成为卒中终身风险最高和疾病负担最重的国家[7]。PSCI是氧化应激、炎症反应等多因素共同作用的结果。其中，作为参与了血管损伤与神经元损伤、脑内淀粉样病变等多个病理过程的重要机制，氧化应激在PSCI发生发展中起着重要作用，针对这一机制的相关治疗手段研究具有重要意义[8]。SOD、MDA是衡量机体的抗氧化能力的重要指标，其中SOD具有清除超氧阴离子的作用，而MDA是脂质过氧化的最终产物[9-10]。本实验发现经神庭穴、百会穴电刺激治疗后，MCAO大鼠脑组织SOD含量升高、MDA含量降低，说明电针治疗百会穴、神庭穴可调节机体抗氧化能力，进而起到保护脑组织的作用。

中医认为，PSCI在中医学属“中风”“健忘”“呆病”“痴症”等范畴，其病机包括肾精亏虚、髓海失充、痰浊血瘀和清窍痹阻等，最终引起神机失用，临床表现为记忆力、理解力、定向力与空间能力减退等症状。针灸作为中医中多种非药物治疗方式之一，被广泛应用于多种疾病的治疗，并因其具有应用范围广、起效迅速、疗效显著、副作用小、操作简便与成本低廉等优势，在世界范围内日益普及。中医认为，针刺可以通过刺激腧穴，起到疏通气血、调和阴阳的作用，进而取得益智健脑，奉养“元神”的功效，所以在神志疾病中应用尤为广泛。近年有多项临床研究表明，针刺治疗有助于降低脑卒中后遗症发病率，并可有效缓解认知障碍症状。张含等选取50例卒中后轻度认知障碍患者分别在脑血管病基础治疗外给予单纯认知康复训练治疗和认知康复配合头穴针灸法治疗，通过统计患者MoCA评分、MMSE评分及ADL评分观察各组疗效，结果显示基础治疗配合头穴针灸法可有效改善患者认知功能，提高患者日常生活能力[11]。杨金华等对70例PSCI患者分别采用常规基础治疗结合康复训练疗法和在基础治疗与康复训练基础上配合针刺进行治疗，通过对比采用不同疗法的两组患者的瞬时记忆评分、蒙特利尔认知评估和延迟记忆评分、血管性痴呆辨证分型表中肾实质功能不全评分以及两组患者治疗前后的事件相关电位P300的潜伏期及波幅变化情况，发现针刺能有效改善PSCI患者的认知功能和中医证候评分，配合针刺的治疗总效率高于单纯常规疗法[12]。此外还有靳三针联合多奈哌齐治疗PSCI，通督调神针法治疗PSCI等相关临床研究，均显示针刺可对卒中后患者的认知功能恢复起到良好促进作用[13-14]。电针是一种将针刺与微电流刺激相结合的治疗方法，通过在毫针针刺得气后施以脉冲电流以辅助传统行针手法，加强针刺的疗效。与常规针刺相比，电针具有刺激量强、方便灵活和针感持久等优势，目前已广泛应用于临床。本实验对MCAO模型大鼠百会穴、神庭穴施以电刺激治疗，发现与模型组比较，治疗组逃避潜伏期缩短、目标象限停留时间延长和穿越原平台次数增加，并通过对比各组大鼠脑组织含水量发现电针治疗后脑组织含水量明显降低。实验结果提示电针百会穴、神庭穴可有效改善卒中大鼠认知功能，减轻脑水肿症状。

PI3k/Akt信号转导通路是机体内重要信号转导途径之一，与多个信号通路及生理功能联系密切，可见于多种疾病如癌症、糖尿病、心血管疾病与神经系统疾病等相关机制研究。有相关研究显示，PI3k/Akt信号通路可通过磷酸化GSK-3β、活化Nrf2等机制减轻氧化应激对脑组织和神经细胞的损伤[15]。目前，临床上应用的多种神经保护药物如阿托伐他汀、异丙酚和雌二醇以及脑缺血预处理技术、亚低温技术等均可通过调节PI3k/Akt通路发挥神经保护作用。本研究通过qPCR法检测模型大鼠脑组织PI3k及Akt mRNA表达水平，发现与模型组相比，治疗组PI3k及Akt表达均有所提升，说明电刺激神庭穴、百会穴可激活大鼠PI3k/Akt信号通路，结合酶联免疫结果推测，其可能是神庭穴、百会电针法治疗PSCI机制之一。

综上所述，电刺激百会穴、神庭穴可改善脑卒中大鼠认知功能，减轻卒中大鼠脑水肿症状，提高大鼠机体抗氧化水平，其作用机制可能与激活PI3k/Akt信号通路有关。在今后的研究中，可对百会穴、神庭穴电针治疗卒中后认知障碍的具体下游机制进行进一步探索研究，为临床治疗卒中后认知障碍提供更可靠、更明确和更具实践意义的临床诊疗依据及研究基础。