针刺督脉腧穴对APPswe/PS1dE9转基因阿尔茨海默病小鼠的治疗机制研究

刘 辉，李佩芳，孙培养，吴 杰

(安徽中医药大学第二附属医院，安徽 合肥 230061)

随着社会经济的发展，我国人口老龄化程度进一步加深，老龄化人口比例逐年增加，导致阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)患病人数日趋升高，死亡率逐年攀升[1-2]。AD是引起中老年人痴呆的常见原因之一，临床表现包括记忆、学习能力下降、日常生活能力降低和行为异常，并伴随各种精神神经症状[3-4]。AD的病因、发病机制仍未十分明确，其两大病理特征表现为以β-淀粉样蛋白(Bate amyloid protein，Aβ)沉积而成老年斑(Senile plaques，SP),同时出现大量的神经元突触的丢失和炎症导致神经元变性[5]。目前针对AD不同发病机制和环节，可模拟AD患者SP、NFTs等主要病变的AD转基因小鼠孕育而生，其中APPswe/PS1dE9双转基因小鼠是目前国际较为认可的AD动物模型，该模型从美国Jackson实验室引进，可同时表达小鼠阮病毒蛋白启动子的突变人类早老素(DeltaE9)和人鼠淀粉样前蛋白(APPswe)[6-7]。本研究采用针灸督脉治疗APPswe/PS1dE9双转基因小鼠，并利用水迷宫和旷场实验验证治疗效果后，通过i TRAQ技术筛选出针灸督脉治疗前后的差异蛋白，并利用Western blot验证差异蛋白表达水平，可为挖掘AD治疗提供蛋白水平层面的依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

APPswe/PS1dE9双转基因小鼠为同时转入淀粉样前体蛋白基因(APP)K670N突变基因和早老蛋白1基因(PS1)dE9突变基因的转基因小鼠，7月龄，SPF级，购于邳州市东方养殖场，许可证号SCXK(苏)2017-0003，饲养于江西中洪博元生物技术有限公司动物实验室。所有实验动物的操作及饲养均符合江西省动物管理饲养条例，遵循人道原则。动物于实验前置于实验室1周适应环境，室温20～26 ℃，湿度40%～70%，自由进食和饮水，实验时保持室内安静。

1.2 实验试剂和仪器

1.2.1 试剂 iTRAQ试剂盒(货号：4390812；厂家：AB Sciex)；乙腈ANC(货号：A998-4；厂家：美国Fisher)；甲酸(formic acid)(货号：64186；厂家：美国Thermo)；胰酶(货号：V5280；厂家：Promega)；缓冲液试剂盒(货号：4381664；厂家：AB Sciex)；BCA蛋白定量试剂盒(BCA Protein Assay Kit)(货号：CW0014S；厂家：康为世纪)；封闭专用脱脂奶粉(货号：P1622；厂家：北京普利莱基因技术有限公司)；牛血清白蛋白(BSA)(货号：A8020；厂家：索莱宝)；超敏发光液(货号：RJ239676；厂家：赛默飞)；内参一抗：Mouse Monoclonal Anti-GAPDH(货号：TA-08；厂家：中杉金桥；稀释比∶1/2 000)；二抗：辣根酶标记山羊抗鼠IgG(H+L)(货号：ZB-2305；厂家：中杉金桥；稀释比∶1/2 000)；目的一抗：Rabbit Anti VGluT1(SLC17A7) (货号：DF13657；厂家：Affinity；稀释比∶1/500)；目的一抗：Rabbit Anti GLAST(SLC3A1)(货号：20785-1-ap；厂家：proteintech；稀释比∶1/500)；目的一抗：Rabbit Anti FAM98A(货号：NBP2-38291；NOVUS；稀释比∶1/500)；二抗：辣根酶标记山羊抗兔IgG(H+L)(货号：ZB-2301；中杉金桥；稀释比∶1/2 000)； Marker(货号：#26617；厂家：美国Thermo)。

1.2.2 仪器 Morris水迷宫(型号：JLBehv-MWMG；厂家：上海玉研科学仪器有限公司)；自发活动系统(型号：JLBehv-LAG-4；厂家：上海玉研科学仪器有限公司)；针灸针(型号：20010020；厂家：苏州医疗用品厂有限公司)；质谱仪(型号：Thermo Scientific Q Exactive ；厂家：美国Thermo)；超声破碎仪(型号：LTD JY96-ⅡN；厂家：宁波新芝)；冷冻离心机(型号：H2050R；厂家：湘仪)；酶标仪(型号：ELx800；厂家：美国BioTek)；液相色谱仪(型号：Dionex Ultimate 3000 RSLCnano；厂家：美国Thermo)；色谱柱(型号：75 μm i.d. x150 mm, packed with Acclaim PepMap RSLC C18,2 μm,100Å；厂家：nanoViper)；PVDF膜(型号：IPVH00010；厂家：Millipore)；全自动酶标仪(型号：WD-2102B；厂家：北京市六一仪器厂)；蛋白垂直电泳仪(型号：DYY-6C；厂家：北京市六一仪器厂)；超高灵敏度化学发光成像系统[型号：Chemi DocTM XRS+；厂家：伯乐生命医学产品(上海)有限公司]。

1.3 动物分组

将8只7月龄APPswe/PS1dE9转基因雄性幼鼠随机分为模型组和针刺组，每组4只。

1.4 治疗方法

针刺组的4只APPswe/PS1ΔE9转基因小鼠，参照《实验针灸学》[8]每只每天在清醒状态下针灸百会、风府、神庭与水沟穴1次，行捻转手法，采用0.20 mm×15 mm针灸针进针深度2～3 mm，留针20 min，持续28 d。模型组不做任何治疗，与针刺组平行评估。

1.5 水迷宫测试

训练时段：第1～5天，逃生平台未设置物品，经随机方式确定其中4个方向，控制动物面向缸壁，再置于水中，相邻两次入水的间隔期为15 min，正式测试，对数据进行准确记录；空间探索：始自第6天，将逃生平台撤除，再任选1个方向，把动物直接置入水内，对相关数据进行记录。

1.6 旷场实验

准备仪器：将自发活动箱摄像头、灯光打开，连接电脑，设置相应的参数。自发活动：将适应房间2 h的小鼠放入自发活动箱中，软件记录动物其活动30 min。

1.7 i TRAQ技术筛选APPswe/PS1dE9转基因小鼠和针刺组之间的差异蛋白。

1.7.1 样品信息 i TRAQ技术所用到的样本信息见表1。

表1 样本标记信息

1.7.2 蛋白质提取 在1 mL预冷的RIPA中加入5 μL磷酸酶抑制剂、1 μL蛋白酶抑制剂和10 μL MSF混匀，冰上保存数分钟后待用。取两组海马组织样品，加入液氮研磨至粉末，加入0.8 mL前述配好的预冷RIPA，应用超声破碎仪破碎，13 000 g/min离心20 min，吸出上清液。滴加4倍体积-20 °的冰丙酮，-20 °沉淀120 min,1 200 g, 4 ℃，离心30 min。弃上清，蛋白沉淀加入300 μL RIPA，超声5 min助溶，4 ℃，12 000 r/min，离心20 min，取上清至新离心管，测定其吸光值，并按照标准的曲线计算每份样品的蛋白浓度。

1.7.3 蛋白酶切 待完成蛋白定量，将0.1 mg蛋白溶液移至离心管内，再添加4 μL的TCEP Reducing Reagent，接着于37 ℃时，进行60 min反应；添加2 μL的MMTS Cysteine-Blocking Reagent，再于室温下进行0.5 h暗反应；接着把已结束还原烷基化处理的蛋白溶液移至超滤管(10 Kd)内，在12 000离心场力下作用20 min，接着将收集管最下端的溶液清理掉；之后添加0.1 mL酸碱度为8.5的尿素(8 M)，之后于12 000离心场力下作用20 min，结束后将收集管最下端溶液倒掉，以上操作进行两遍重复；添加0.1 mL的Dissolution Buffer，于12 000离心场力下作用20 min，结束后将收集管最下端溶液倒掉，并进行3遍重复；之后准备1支新收集管，通过Dissolution Buffer定容至0.05 mL，根据蛋白与胰蛋白酶(Trypsin)50∶1的质量比，添加一定量的Trypsin，于37 ℃下进行一整夜作用；第2天，添加Trypsin(蛋白与Trypsin的质量比为100∶1)，于37 ℃下作用4 h，再于12 000离心场力下作用20 min，结束后收集管最下端为行酶解消化处理的肽段溶液；将0.05 mL的Dissolution Buffer添加至超滤管内，于12 000 rpm离心场力下作用20 min，和上步合并，对管底部溶液进行收集，合计获得已酶解样品0.1 mL。

1.7.4 i TRAQ试剂标记 自冰箱内将8标的i TRAQ试剂盒取出，再平衡至室温水平，经离心处理，使i TRAQ分布于管底；各管i TRAQ试剂皆添加0.15 mL异丙醇(IPA)，行涡旋振荡处理，离心至最下端；将0.05 mL样品(0.05 mg酶解产物)移入新离心管内；向样品内加入i TRAQ试剂，行涡旋振荡处理，离心至最下端，于室温中作用120 min；添加0.1 mL水，使反应结束；混合标记后的样品，行涡旋振荡处理，离心到最下端；接着行真空离心干燥处理；把已抽干样品存放于冷冻环境中，备用。

1.7.5 第一维高pH-RP液相分离 先通过A相(95%)、B相(5%)平衡柱子0.5 h；再通过0.2 mL A相复溶已标记、抽干的混合多肽；先取0.1 mL进样，再实施梯度洗脱处理，速率为0.2 mL/min：B相自5%至37%，最后5 min内B相占比增到95%，同时保持5 min，接着洗脱掉全部多肽，用时合计85 min。每50 s接1次，单次85 min，如此进行循环接样；最后合计收取48个组分，统一为13组分，先行真空干燥处理，再实施第2维的LC-MS分析。见表2。

表2 流动相参数说明

1.7.6 第二维反相液质联用RPLC-MS 通过样品溶解液(乙腈、甲酸各5%、0.1%)对肽段进行溶解，先行彻底振荡涡旋处理，于4 ℃温度、13 500 r/min速度下，实施20 min离心处理，上清移入上样管内，开展质谱鉴定。参数设置情况详见表3、4。已分离肽段直接进入质谱仪接受在线测定。参数设置情况详见表5。

表3 液相色谱设置参数

表4 流动相参数

表5 质谱设置参数

1.7.7 数据库检索 本项目Proteome Discoverer 2.2(Thermo fisher)软件进行数据库检索，采用PEAKS软件进行数据库检索。具体检索参数见表6。

表6 鉴定参数

1.8 Western blot验证差异蛋白

取APPswe/PS1△E9转基因小鼠模型组和针刺组海马组织液氮上研磨后添加裂解液，再移至冰上接受0.5 h裂解处理，接着于10 000 rpm/min 离心场力、4 ℃温度下作用10 min，留存上清，即为总蛋白。根据BCA试剂盒所示，对蛋白浓度展开测定。蛋白变性，上样，接着实施60～120 min的十二烷基苯磺酸钠(SDBS)凝胶电泳处理，再湿法转膜30～50 min。于4 ℃下移至一抗溶液内，进行一整夜孵育；再移至二抗溶液内，于室温下进行1～2 h孵育。将ECL曝光液滴于膜上，借助凝胶成像系统进行曝光。最后借助软件Image J对各条带灰度值展开分析。

1.9 统计学处理

2 实验结果

2.1 针灸督脉穴位治疗APPswe/PS1dE9转基因小鼠的行为学检测

2.1.1 水迷宫实验结果 与模型组比较，针刺组小鼠第3、4天潜伏期缩短;与模型组比较，针刺组小鼠穿越平台次数增多。见图1。

图1 定位航线实验结果和定位航线穿越平台结果

2.1.2 旷场实验检测针灸督脉治疗对APPswe/PS1dE9转基因小鼠的运动能力影响 APPswe/PS1dE9转基因小鼠模型组在旷场中的总运动距离为(6 252.11±2 144.73)mm，针刺组为(6 952.96±4 794.97)mm,比模型组总运动距离增加;模型组中心区域运动距离为(34 757.14±5 364.25)mm，针刺组为(35 437.31±10 968.10)mm，比模型组中心区域运动距离增加。见图2。

图2 旷场实验结果

2.2 各组小鼠海马的差异蛋白表达

与模型组比较，针刺组差异蛋白上调23个、下调61个。

2.2.1 差异指标筛选 此项研究的过滤标准为：同时满足fold change≠1.2倍、P值在0.05以下的条件。针对蛋白质通过变异倍数分析(FC Analysis)以及T检验开展单变量统计分析，同时完成火山图的绘制。经由图3可知，样本间代谢物存在显著性变化。

注：红色、蓝色分别代表显著上调和下调的蛋白质(FC在1.2以上, P在0.05以下)。

2.2.2 差异指标聚类分析 对于各组样本，通过定性所得显著性差异代谢物的表达水平实施层次聚类，经由图4能够发现，模型组、针刺组样本可经由聚类见于同一簇内。

图4 蛋白质聚类分析图

2.3 生物信息学分析

本研究的蛋白差异分析主要采用GO和KEGG富集分析，方便更全面、更系统地掌握细胞的生物学行为、药物作用机制、性状或病机等信息。

2.3.1 Gene Ontology(GO)富集分析 本研究采用WebGestalt软件对筛选所得差异蛋白质实施GO富集分析。经由差异蛋白的GO分析，对比于模型组，针刺组表达差异的蛋白质有52个，主要涉及神经肌肉控制平衡过程、药物跨膜转运和酸性氨基酸跨膜转运等信号途径，图5为展示的前20个差异蛋白。

注：横坐标表达的是富集到的蛋白质数量，纵坐标表示富集到的主要通路，P-value是富集分析的显著性指标，P-value越小表示其通路在特定的生物学处理下所受的影响越大，由超几何分布计算。

2.3.2 KEGG富集分析 本研究采用WebGestalt软件和KEGG数据对筛选的差异蛋白质进行富集分析，通过差异蛋白的KEGG分析，与模型组比较，针刺组表达差异的蛋白质有52个，主要有疟疾、糖尿病与甲状腺癌等疾病，调节脂肪细胞中的脂肪分解、cGMP-PKG等信号通路，图6为展示的前20个差异蛋白。

注：横、纵坐标分别代表富集所得蛋白质数量、主要通路，P值代表富集分析的显著性水平，此项指标愈小说明其通路于特定的生物学干预下所受的影响愈大，由超几何分布计算。

2.3.3 Western blot检测筛选出的差异蛋白表达情况 如图7和表7所示为利用Western blot验证i TRAQ筛选出的FAM98A、SLC3A1及SLC17A7共3个差异蛋白的结果图，由图、表中可知，与模型组比较，FAM98A、SLC3A1及SLC17A7在针刺督脉治疗后的模型鼠的海马组织中表达显著上升。

注：与模型组比较，*P<0.05。

表7 Western blot检测筛选出的差异蛋白表达情况

3 讨论

近年来，AD患病导致的人口死亡率显著上升，对AD早发现早治疗是极必要的。对AD的治疗除了主要的乙酰胆碱酯酶抑制剂和美金刚外，多项临床研究及实验研究结果提示针刺对AD模型的行为学、神经递质能产生有益的影响[9-11]。本研究采用针灸督脉治疗 AD相关研究中常见的动物模型APPswe/PS1dE9双转基因小鼠，通过水迷宫和旷场实验行为学观察治疗效果。相关研究表明[12-13]电针能提高AD模型鼠的学习记忆能力，朱书秀等[14]认为电针刺激后抑制了模型鼠脑内胶质细胞的活化，同时减少神经毒性因子的释放，从而达到提高AD模型鼠的学习记忆能力的效果。

AD属于中医“呆病”“健忘”等范畴。中医学认为其病位在脑，与心、肝、脾和肾功能失调关系密切。历代医家素有“病变在脑，首取督脉”之说。《难经·二十八难》记载:“督脉者，……上至风府，入属于脑。”脑是元神之府，督脉的1条支脉有“上贯心”，心藏神，心神与脑神共司精神、情志活动。督脉还有1条支脉“络肾”，肾藏精，精充可化神。《备急千金要方》云:“烦闷恍惚，喜怒无常……次灸百会一处七壮。”《针灸大成》言百会治“惊悸健忘，忘前失后，心神恍惚，无心力……”，《铜人腧穴针灸图经》亦曰:“神道主健忘惊悸。”针灸督脉治疗范围的描述与现代医学AD的某些症状十分相似，表明针刺督脉对AD有一定的治疗作用,是在针刺督脉经穴百会、神庭、风府与水沟为主防治中风病的基础上发展起来的，以针刺督脉达到通调神志功用。临床研究发现，以百会、水沟、神庭与大椎等穴位为主穴，运用该针法治疗PSD疗效显著，但临床疗效机制尚不清楚。

现今借助神经影像学可以直观了解病人海马的病变状况，但进行神经影像检查时，检查对象需要长期保持固定姿势，较难操作，也存在价格昂贵的弊端。本研究以模型组和针刺组小鼠为研究对象，借助适宜的蛋白质组学分析方法，针对此类方法的优劣势与适用性，在实验中联合应用，筛选出AD治疗的候选蛋白，并通过Western blot技术进行验证，从而从候选生物标志物中鉴定出可信的治疗靶点。

本研究以模型组和针刺组海马组织为研究对象，运用i TRAQ和蛋白芯片技术，研究治疗AD的蛋白靶点，从众多差异蛋白中挑选FAM98A、SLC3A1及SLC17A7共3个与疾病、尿酸代谢和激素释放相关蛋白进行验证。目前关于FAM98A蛋白生物学功能的报道还很少，有研究显示[15]FAM98A在人体内的脑组织和睾丸组织中高表达，在卵巢癌组织中作为一种精氨酸甲基转移酶的底物发挥作用。研究证实[16]下调FAM98A蛋白的表达后，结肠癌细胞的增值、迁移和侵袭等能力显著下降，同时相关的蛋白水平表达发生改变，提示FAM98A蛋白表达参与人体内的脑组织疾病发生。碱性氨基酸转运载体基因SLC3A1对于机体生长发育起着关键性作用，其负责编码的rBAT蛋白为动物碱性氨基酸(AA)转运体系的关键构成单元。研究结果表明[17]SLC3A1基因的突变会引起肾小管减少对胱氨酸等多种氨基酸的重吸收，严重影响人体对营养物质的吸收，调查显示大多数阿尔茨海默症患者为营养缺乏的老年人[18]，提示SLC3A1可能参与AD鼠的营养摄取。研究表明[19]，SLC17A7编码cl-依赖性囊泡性谷氨酸转运体存在于大脑和内分泌组织中，编码的蛋白参与跨膜囊性谷氨酸，在激素的释放中起到一定的作用，提示SLC17A7可能参与AD鼠大脑中的激素分泌。

综上所述，本研究通过针刺督脉腧穴治疗AD模型小鼠后，FAM98A、SLC3A1及SLC17A7表达显著上升，提示FAM98A、SLC3A1及SLC17A7可作为AD治疗的靶位点。为了进一步确认这些预测靶点是否参与AD小鼠的治疗过程，在后续研究中，可通过上调或下调AD小鼠内FAM98A、SLC3A1及SLC17A7的表达并运用行为学对小鼠状态进行治疗评价。