电针对创伤性颅脑损伤大鼠脑组织中p-4E-BP1及VEGF蛋白表达的影响

马怡林，吴 涛△，王瑞辉，杨 琪

(1.陕西中医药大学，陕西 咸阳 712046；2.西安国际医学中心医院，陕西 西安 710061)

创伤性颅脑损伤(Traumatic brain injury，TBI)是指外力对颅脑产生直接或间接用力后引发的脑组织结构性损伤和(或)大脑功能生理性中断[1]。这一病症涵盖了脑水肿、脑血管破裂出血、脑组织挫伤和特定脑区的轴索损伤等一系列致病事件[2]。TBI发生后出现神经血管机械性损伤等原发性损伤和颅内压升高、血脑屏障破坏等继发性损伤的病理生理特征[3]。现代临床研究显示，TBI已经成为了一种危及人类生命安全的公共卫生问题。但到目前为止，还未发现能够通过靶向继发性损伤机制来赋予神经保护作用的药物治疗TBI[4]。而针灸作为一种中华民族传统疗法，具有安全、起效快、方便、治疗时间短、起效时间长与副作用小等优势。有研究表明，电针治疗能够很好地改善脑缺血再灌注损伤[5]，亦有诸多报道证实了电针对TBI后肢体运动、语言和认知等功能恢复确有较佳的疗效[6]。通过电针刺激穴位可促进一些内源性营养神经、抗凋亡因子的表达，并下调某些促炎因子的表达，促使脑损伤后的神经发育新生，降低线粒体的损伤程度，阻止神经细胞的凋亡[7]，促进星形胶质细胞增殖，调节脑血流，减轻脑损伤缺血后颅内炎症及水肿，一定程度上延长生存期[8]。为进一步明确电针治疗TBI起效的作用机制，本研究通过Feeny自由落体打击法建立TBI大鼠模型，应用mNSS评分评价大鼠造模前后神经功能缺损程度，免疫印迹法以及免疫组化法观察大鼠脑组织中真核起始因子4E结合蛋白1 (Eukaryote initiating factor 4E binding protein 1, 4E-BP1)和血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)的表达情况，以期揭示电针治疗TBI的部分效应机制，为临床采用针灸治疗TBI提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

清洁级健康雄性6周龄SD大鼠70只，体质量(200±20)g，购自成都达硕动物实验中心，许可证编号：SCXK(川)2015-30。按照12 h/12 h昼夜循环标准饲养于陕西中医药大学医学科研试验中心动物房，自由饮水进食，实验室温度(25±2)℃，湿度(50±5)%，1周后随机预留16只作为假手术组及空白组，其余54只用于Feeney自由落体打击法造模，造模过程中及造模后死亡6只，最终顺利成活并达到模型制备成功标准的大鼠共48只，平均分为模型组(24只)、电针组(24只)。全程遵循《国家医学实验动物管理条例》各项规定对实验动物严格进行喂养及处理。

1.2 主要试剂及仪器

1.2.1 仪器 P16011A微型磨钻(浩峰仪器公司)；ST-3ND脑立体定位仪(成都仪器公司)；华佗牌无菌针灸针(苏州医疗用品厂有限公司)；CR22G高速冷冻离心机(日本日立公司)；XHF-D匀浆机(南北仪器公司)；JY600电泳仪(君意东方公司)；SpectraMax5酶标仪(美国Molecular Devices公司)；Zeiss A1研究级正置数码显微镜(德国卡尔蔡司公司)；G6805-2A电针治疗仪(华谊公司)。

1.2.2 试剂 BSA牛血清白蛋白(A2153，美国 Sigma公司)；p-4E-BP1抗体(SC-293124，美国Santa cruz公司)；VEGF抗体(SC-7269，美国Santa cruz公司)；PVDF膜(IPV H00010，索莱宝公司)；预染蛋白质分子量标准(P0066)、BCA蛋白浓度试剂盒(P0010)、RIPA裂解液(P0013B)、蛋白上样缓冲液(6×)(P0015F)、SDS-PAGE凝胶(P0012A)、BeyoECL Plus(P0018)、PMSF(ST506)和β-Actin 抗体(AF0003)(碧云天公司)；免疫组化试剂盒(Kit-9902)、DAB 显色试剂盒(DAB-0031)(迈新公司)；戊巴比妥钠(上海上药新亚药业有限公司)。

1.3 TBI模型制备

实验参照改良Feeney自由落体打击法制备TBI模型[9]。用2%的戊巴比妥钠对模型组和电针组大鼠进行腹腔注射麻醉(0.2 mL/100 g)，麻醉起效后剔除术部鼠毛，脑立体定位仪固定大鼠后在大鼠头正中点左侧0.5 cm处，切一1.5 cm左右的纵向切口，并充分暴露颅骨，用微型磨钻在冠状缝后6 mm，矢状缝左侧旁开4 mm处开一直径约5 mm的骨窗，其间需使硬脑膜完整；将20 g的砝码从长35 cm的透明玻璃管中垂直下落打击骨窗，造成左脑顶叶损伤。常规外科消毒缝合后，腹腔注射硫酸庆大霉素注射液0.02 mL/100 g，预防术后感染，后进行单笼常规喂养。假手术组只开骨窗不进行打击。空白组作为对照观察不进行处理。造模后采用mNSS评分评定大鼠即刻神经功能，7～12分则为造模成功。本实验造模过程中及造模后死亡6只，最终顺利成活并达到模型制备成功标准的大鼠共48只。

1.4 电针干预方案

造模后24 h参照《大鼠穴位图谱的研制》[10]对电针组大鼠进行电针干预治疗，取“百会穴”“水沟穴”、患侧“内关穴”“足三里穴”,水沟穴：直刺2 mm，点刺20 s后不留针；百会穴：平刺5 mm；内关穴：直刺3 mm；足三里：直刺5 mm。内关和足三里给予带电治疗，2 Hz断续波，强度1 mA，15 min/次，1次/ d，连续治疗14 d。针具选取华佗牌一次性针灸针(0.25 mm×25 mm)，电针仪选取 G6805-2A型电针仪。模型组和假手术组同时抓取固定10 min。空白组不作干预。

1.5 取材及指标检测

1.5.1 行为学检测大鼠神经功能损伤程度 采用mNSS评分[11]评估大鼠神经功能。评价方法主要包括：运动(6分，行走实验、提尾实验)、感觉(2分，本体觉、痛温觉)、反射(3分，耳廓反射、角膜反射以及惊恐反射)、平衡木实验(6分)及非正常性运动(1分)构成，评分范围0～18 分(正常为0分，最大缺损评分为18分)，分数越高说明存在神经功能缺失的部分越多。于正式测试前先对所有组的大鼠依据mNSS量表各项项目开展适应性训练，并在造模后第24 h、3 d、7 d和14 d进行正式测试，最终进行各组mNSS评分的统计学分析。

1.5.2 大鼠脑组织取材 模型组和电针组在造模后3 d、7 d和14 d行为学检测完成后取材；假手术组和空白组在造模后14 d全部一并取材。用2%的戊巴比妥钠(0.2 mL/100 g)对大鼠进行腹腔注射麻醉，剪开胸骨，充分暴露心脏，用0.9%氯化钠溶液(4 ℃预冷)灌注，从右心耳灌注入，待大鼠各脏器颜色变白，血液被冲出体内后取出脑组织。将取出的大鼠脑组织以损伤部位为中心平均分成两部分：一部分放置在EP管内，疾速冰冻储存在-80 ℃冰箱，为后期研究的提取蛋白和进行WB检测作准备；另一部分脑组织置于冰4%多聚甲醛中进行固定(固定时间不超过24 h)。固定完成后开始对组织进行脱水和包埋进一步处理，作为后期石蜡切片的免疫组化等病理学检测标本。

1.5.3 免疫组织化学法检测脑组织vp-4E-BP1、VEGF的阳性表达 石蜡切片脱蜡后进行抗原修复，完成后加3%过氧化物酶阻断剂，静置10 min后，用PBS溶液清洗3 min×3次；以5%BSA将切片封闭30 min后取出片子不洗，加一抗溶液后在4 ℃环境过夜；次日复温1 h后用PBS溶液洗5 min×3次，完成后均匀滴加反应增强液及聚合物，将DAB显色液均匀滴加；最后用自来水缓慢冲洗后放入苏木素溶液盒进行染色，染色完成后对组织进行梯度乙醇脱水及二甲苯透明，完成后以中性树胶滴加封片，200×光学显微镜下观察。

1.5.4 Western blot法检测创伤脑组织p-4E-BP1、VEGF的阳性表达 取上述冻存损伤脑组织，配制好工作液后加组织裂解液匀浆，提取上清液。检测脑组织总蛋白浓度，上样、电泳、转膜和封闭(5%脱脂奶粉)。目标蛋白抗体用一抗稀释液稀释至合适浓度后，4 ℃摇床过夜后复温1 h，TBSB溶液洗涤10 min×3次，二抗TBST稀释后室温孵育1 h，TBST洗涤10 min×3次，膜上滴加发光液，调整好曝光显影拍照软件进行拍照。

1.6 统计学处理

2 结果

2.1 各组大鼠一般情况及行为学比较

造模后2～4 h各组大鼠开始苏醒。空白组大鼠神经功能正常，未见神经功能缺损表现；假手术组大鼠模型制备后24 h、3 d表现出轻度神经功能不全；模型组及电针组大鼠造模后均存在精神颓靡，行动欠协调、饮食减少、行走时偏离直线、右侧肢体运动及感觉障碍等神经功能缺损现象。伴随时间的迁延，模型组及电针组大鼠mNSS评分下降，精神状态、饮食及运动开始逐渐恢复，对比发现电针组大鼠的各项评分及生活状态与模型组比恢复情况较佳(P<0.01)。见表1。

表1 各组大鼠mNSS评分情况

2.2 免疫组化检测电针对SD大鼠脑组织中p-4E-BP1蛋白表达的影响

对大鼠脑组织切片进行免疫组化染色后，可见p-4E-BP1阳性表达呈圆形或类圆形棕黄色斑片，在空白组和假手术组大鼠脑组织中仅有少量p-4E-BP1阳性表达，空白组与假手术组比较差异无统计学意义(P>0.05)；模型组和电针组在造模后3 d、7 d和14 d有程度不一的阳性表达，各时间点电针组p-4E-BP1表达量均高于模型组(P<0.05)；模型组、电针组与空白组、假手术组进行比较后差异有统计学意义(P<0.01)。见图1、表2。

图1 免疫组化检测大鼠脑组织中 p-4E-BP1的表达(免疫组化染色200×)

表2 各组大鼠脑组织中p-4E-BP1表达情况

2.3 免疫组化检测电针对SD大鼠脑组织中VEGF蛋白表达的影响

对大鼠脑组织切片进行免疫组化染色后，可见VEGF阳性表达呈圆形或类圆形棕黄色斑片，在空白组和假手术组仅有少量阳性表达，空白组与假手术组比较差异无统计学意义(P>0.05),模型组和电针组则有增多程度不一的VEGF阳性表达，各时间点电针组的VEGF表达量均高于模型组(P<0.05)；与空白组、假手术组相比较，模型组与电针组的VEGF含量表达差异均具有统计学意义(P<0.01)。见图2、表3。

图2 免疫组化检测脑组织中VEGF的表达(免疫组化染色200×)

表3 各组大鼠脑组织中VEGF表达情况

2.4 各组大鼠脑组织p-4E-BP1蛋白免疫印迹法表达的结果

经过分析蛋白条带的平均灰度值发现，空白组与假手术组脑组织中含有少量的p-4E-BP1蛋白表达，在造模后14 d，模型组与空白组、假手术组比较，差异具有统计学意义(P<0.05)；模型组和电针组在造模后不同时间出现不同程度的表达增多,各时间点电针组p-4E-BP1蛋白表达量均高于模型组(P<0.05)；电针组与空白组、假手术组相比较差异具有统计学意义(P<0.01)。见图3、表4。

图3 免疫印迹检测脑组织中p-4E-BP1的蛋白表达情况

表4 各组大鼠脑组织中p-4E-BP1蛋白表达情况比较

2.5 各组大鼠脑组织VEGF蛋白免疫印迹法表达的结果

经过分析蛋白条带的平均灰度值发现，空白组与假手术组脑组织中含有少量的VEGF蛋白表达。与空白组和假手术组相比较，模型组和电针组在造模后不同时间点出现不同程度的VEGF蛋白表达增多，各时间点电针组VEGF蛋白表达量均高于模型组(P<0.05)；造模后14 d，模型组与空白组、假手术组比较差异具有统计学意义(P<0.05),电针组与空白组、假手术组比较差异具有显著统计学意义(P<0.01)。见图4、表5。

图4 免疫印迹法检测脑组织中VEGF的蛋白表达情况

表5 各组大鼠脑组织中VEGF蛋白表达比较

3 讨论

创伤性颅脑损伤在中医学中属于外伤性脑病。外伤性脑病其证多属实，后期多为虚证或虚实夹杂，急性期多病情危重，其病理因素主要包括气、血、痰和虚，可相互搏结致病，迁延日久则遗留诸多难治性后遗症。针灸作为一种物理疗法，在中医理论中具有疏通气血、调和阴阳的独特作用，其安全、创伤小和副作用小等优势在国际医疗体系中越来越大放异彩。近现代以来，电针的研发和应用为针灸这一项传统中医疗法赋予了新的意义。TBI发生后原发性损伤无法治疗，重点放在预防上，所以治疗本病的重点在于抑制继发性损伤[12]。研究证实，电针在治疗神经功能紊乱、神经退行性病变、脑和脊髓损伤及其后遗症阶段的肢体运动、语言等功能障碍方面疗效确切[13-14]。1项对重度颅脑损伤迁延性昏迷患者的研究显示，采用电针治疗的观察组昏迷量表评分及相应的血流动力学值上升，临床总有效率达71.2% (52/73),显著高于对照组的41.1%(30/73),差异具有统计学意义(P<0.05)[15]。另有研究显示，通过穴位的外周电刺激可促进内源性阿片肽的释放，产生镇痛效应，减轻症状，改善病患的短期预后[16]。对于脑损伤急性期患者，采用低频率电针刺激治疗后患者的颅内灌注压可得到提高，并使D-二聚体水平降低，血浆纤维蛋白原(Fib)水平提高，凝血功能得到改善，防止颅内出血及血栓形成造成的风险，该刺激还促进了患者的意识觉醒，并特异性地上调损伤区内VEGF的表达，帮助脑血管系统的再生与重构[17]。课题组前期研究亦观察到，随着不同时间点电针干预时间的延长，大鼠脑组织中促凋亡相关因子Fas/FasL表达量呈下降趋势，抑制了神经细胞的程序性死亡[18]。因此本研究观察了电针对TBI大鼠神经功能及脑组织中p-4E-BP1和VEGF表达的影响，探讨电针在TBI治疗中发挥作用的可能机制。

经前期研究进行文献收集整理后，本研究遂选用水沟、足三里、百会与内关4个腧穴作为干预观察方法，因其在脑相关疾病研究中最为常用，且具有良好的治疗作用。水沟隶属于督脉，为督脉与足阳明胃经、手阳明大肠经的交会穴，具有通督调神、醒脑开窍的功效。足三里穴为足阳明胃经的下合穴，古典医籍有言“治痿独取阳明”，因此针刺足三里穴对于疏通下肢气血经络、帮助运动功能恢复有极大的作用。百会隶属于督脉，为督脉、手少阳、足厥阴、足少阳和足阳明经的交会穴，位居巅顶，总督一身之脉，能够开窍促醒、补虚升提，为脑部疾病治疗的首选穴位。内关穴，隶属手厥阴心包经，为八脉交会穴，与阴维脉相通，能够调理阴阳，缓解疼痛。

急性脑损伤后，有研究表明在多个实验模型中检测到了自噬标志物——微管相关蛋白轻链3 (LC3)-Ⅱ和自噬相关基因12-ATG5缀合物的存在，这就提供了令人信服的证据证明脑组织受创伤后持续激活了自噬[19]。细胞自噬(Autophagy)，即“自我吞噬”，是一种依赖溶酶体在机体内破坏和回收受损或不必要细胞成分的降解系统，也是真核细胞应对压力时的自我修复过程，以自噬小体的形成为主要特征[20]。在应激状态下促使细胞发生自噬的主要途径是哺乳动物雷帕霉素靶体蛋白(the maimnalian target of rapamycin,mTOR)[21]。mTOR下游最具特征的主要效应物是4E-BP1和p70S6激酶(P70S6K)，mTOR激活后能够促进其下游的重要靶蛋白4E-BP1的磷酸化，进而调节蛋白质的翻译。现代研究证实，磷酸化的4E-BP1(即p-4E-BP1)可促进其下游包括VEGF、细胞周期蛋白(Cyclin D1)和缺氧诱导因子-1α(Hypoxia indu-cible factor-1α, HIF-1α)等对细胞生长有至关重要作用的蛋白翻译, 共同调节基因翻译起始的速度、蛋白质合成与细胞生长，调控细胞自噬，从而延长神经元存活并促进其修复再生[22-23]。Su M等在采用MicroRNA-221抑制自噬促心衰的动物实验中发现，p-mTOR、p-4E-BP1显著上调后，LC3降低，可能为mTOR受到激活，自噬得到抑制[24]，说明p-4E-BP1的表达与自噬的调控有着密切的联系[25-26]。VEGF是通过刺激血管生成，帮助氧向外周传送，涉及内皮细胞迁移、增殖和分化以及水解细胞外基质蛋白的一类蛋白[22]。Dodd K M[27]等发现，显性抑制4E-BP1突变体的表达会对VEGF水平产生显著影响，这反映了mTORC1/4E-BP1信号参与驱动VEGF的表达。在组织缺氧情况下，VEGF表达增加，其存在保证了血管系统的完整性，并有助于调节细胞周期和线粒体基因簇；而在细胞水平上，研究者发现VEGF的失活及耗竭会迫使线粒体断开分裂、遏制细胞内葡萄糖的代谢过程，导致自噬活性增加，进而促使细胞死亡[28]。本研究主要参照梁楠等[9]对动物模型的颅脑损伤制备及评价方法进行造模，mNSS评分结果示电针组、模型组和假手术组在模型制备后都出现了神经功能缺损表现，电针干预治疗后，电针组与模型组神经功能评分有所下降，相同时间点电针组分值减少程度较模型组明显(P<0.01)，大鼠TBI后经电针治疗可以明显降低mNSS评分，减轻神经功能缺损程度，从行为学角度表明电针能够帮助TBI后运动、感觉等神经功能的恢复。空白组和假手术组大鼠脑组织中含有少量的p-4E-BP1和VEGF蛋白，以维持正常的脑组织生长代谢。而当脑组织受到创伤后，经电针干预后的电针组脑组织中的p-4E-BP1和VEGF含量明显升高，但对比同时期模型组,电针组大鼠脑组织中p-4E-BP1和VEGF蛋白含量保持在较高水平,差异具有统计学意义(P<0.05)。

综上所述，本实验研究认为电针能够减缓TBI大鼠神经细胞损伤进程，减轻脑神经细胞形态结构的破坏，从而发挥保护脑神经功能的效用，其机制可能是通过促进TBI大鼠脑组织中的p-4E-BP1及VEGF蛋白的表达，进而调控脑细胞自噬，减轻脑组织的继发性损伤程度，发挥脑保护作用。本实验研究未能对目标蛋白进行阻断后继续检测观察，故在后续工作中有望展开进一步研究。