HPLC-ELSD法同时测定黄芪中两种皂苷成分及大孔树脂纯化工艺研究*

王文宇，方丽波，付恩桃，吴 丹

(合肥职业技术学院生物工程学院，安徽 合肥 238000)

黄芪，为豆科植物蒙古黄芪或膜荚黄芪的干燥根。现代检测分析黄芪所含主要的化学成分为黄芪多糖类、皂苷类、黄酮类化合物等[1]，是补气要药，具有免疫调节、抗感染、抗氧化[2]，抗病毒、抗肿瘤、降血糖和双向调节血压及多种脏器保护[3]等多种作用。皂苷类化合物是黄芪中重要的有效成分之一，随着分离提取、结构鉴定技术的发展，已经先后从膜荚黄芪和蒙古黄芪及其同属近缘植物中分离出40多种三萜皂苷类化合物[4]，主要有黄芪皂苷I-Ⅷ、乙酰基黄芪皂苷、异黄芪皂苷I-Ⅳ、大豆皂苷等四大类。黄芪皂苷Ⅳ(亦称黄芪甲苷)是黄芪总皂苷的有效成分，含量最高，因此黄芪甲苷常作为黄芪药材的定性定量指标[5]。

目前针对于黄芪皂苷成分的提取方法很多，但多较为繁杂且效率较低。此外，对黄芪进行质量控制也多选择以某一个化合物为基础，用内标法对多个皂苷成分进行同时测定的方法较少。实验选取黄芪甲苷和黄芪皂苷Ⅱ作为黄芪药材的定性定量指标并选用人参皂苷Rb2作为内标物，利用大孔树脂吸附能力强、除杂能力好及富集效果显著的优势对黄芪中的皂苷类成分进行富集纯化，再选用蒸发光散射检测器(ELSD)对两种皂苷成分进行分析。为黄芪的进一步开发利用提供可靠的提取纯化工艺方案以及分析检测手段，为黄芪的质量控制提供新的途径，为黄芪皂苷类成分的提取提供新思路。

1 仪器与材料

1.1 仪 器

Waters 2696高效液相色谱仪,美国Waters公司;Waters 2434蒸发光散射检测器,美国Waters公司；旋转蒸发仪,巩义市予华仪器有限责任公司；超声波清洗器,合肥金尼克机械制造有限公司；FA2204B电子分析天平,上海佑科仪器仪表有限公司。

1.2 药品、试剂与耗材

黄芪(产自甘肃定西)，岷县和泰中药材有限公司；黄芪甲苷标准品(批号：AG42117A，纯度≥99%),合肥博美生物科技有限责任公司；黄芪皂苷Ⅱ标准品(批号：AS32106A，纯度≥99%),合肥博美生物科技有限责任公司；人参皂苷Rb2标准品(批号：GR121330，纯度≥99%),合肥博美生物科技有限责任公司；Waters Symmetry C18色谱柱,美国Waters公司；AB-8大孔吸附树脂,东鸿化工有限公司；XDA-1大孔吸附树脂,和成新材料有限责任公司；XDA-5大孔吸附树脂,和成新材料有限责任公司；乙腈(色谱纯),美国TEDIA公司；冰醋酸(色谱纯),国药集团化学试剂有限公司；其他所用试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱为Waters Symmetry C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)，柱温为28 ℃，流动相为0.2%冰醋酸(A)-乙腈(B)，设置梯度洗脱程序，详见表1，进样量10 μL。蒸发光散射检测器设置：漂移管温度为65 ℃，供气压力172.38 Pa。理论板数按内标人参皂苷Rb2计，应不低于5000。

表1 流动相梯度洗脱程序Table 1 The gradient of mobile phase

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备

精密称取29.35 mg黄芪甲苷对照品及20.56 mg黄芪皂苷Ⅱ对照品，分别置50 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，即得黄芪甲苷及黄芪皂苷Ⅱ混合对照品溶液，浓度分别为0.5870 mg/mL及0.4112 mg/mL；精密称取50.46 mg人参皂苷Rb2，置100 mL量瓶中，加甲醇至刻度，即得内标物溶液，浓度为0.5046 mg/mL；分别精密量取上述混合对照品溶液0.5，1.0，2.0，4.0，6.0，置10 mL量瓶中，精密量取内标物溶液各1.0 mL，加甲醇至刻度，摇匀，即得。

2.2.2 供试品溶液的制备

将黄芪置60 ℃烘箱干燥24 h，将其打粉过筛，称量粉末5 g，放入500 mL圆底烧瓶中，加入200 mL 70%乙醇，浸泡12 h后，再次加热，回流提取3次，每次提取时间为1 h，过滤，将过滤溶液蒸干，加入10 mL纯化水使残渣溶解，将溶液转移到分液漏斗中，用乙酸乙酯萃取3次，每次萃取20 mL，萃取完成后将非乙酸乙酯层丢弃，将乙酸乙酯层转移到蒸发皿中，浓缩干燥，加甲醇定容到10 mL容量瓶中，用0.22 μm微孔滤膜过滤，分别精密吸取上述溶液及人参皂苷Rb2内标物溶液各1.0 mL，摇匀，即得。

2.3 方法学考察

2.3.1 专属性试验

分别吸取甲醇溶液、供试品溶液、对照品溶液，按照给定的色谱条件进样分析，记录色谱图。结果显示，对照品溶液色谱图中黄芪甲苷、黄芪皂苷Ⅱ、人参皂苷Rb2的保留时间分别为19.5 min、22.9 min、16.1 min左右。供试品溶液相同保留时间处也可检测到三种物质的色谱峰，分离度良好且在出峰位置无干扰。结果见图1。

图1 色谱图Fig.1 HPLC chromatograms

2.3.2 线性关系试验

精密吸取以上系列对照品溶液10 μL注入色谱仪，记录峰面积，以黄芪甲苷或黄芪皂苷Ⅱ进样量的自然对数值(X)为横坐标，内标物与黄芪甲苷或黄芪皂苷Ⅱ峰面积比值的自然对数值(Y)为纵坐标绘制标准曲线，经计算得黄芪甲苷回归方程为Y=-1.1367-0.3261，R2=0.9994；黄芪皂苷Ⅱ回归方程为Y=-1.2452-0.4637，R2=0.9997。结果表明，黄芪甲苷进样量在0.2935～2.9350 μg，黄芪皂苷Ⅱ进样量在0.2056～2.0560 μg，两者的进样量自然对数值与人参皂苷Rb2和两者峰面积比值自然对数值呈良好的线性关系。

2.3.3 重复性试验

精密吸取2.2.1项下未加内标物的混合对照品溶液0.5，3.0，6.0，分别置10 mL量瓶中，再精密加入1.0 mL内标物溶液，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得低、中、高三个浓度梯度的标准品溶液。按上述“2.1”项的色谱条件，重复进样5次，记录峰面积。由标准曲线求得各浓度，计算重复性。结果显示，黄芪甲苷及黄芪皂苷Ⅱ的RSD分别为1.53%和0.89%，表明本方法的重复性良好。

2.3.4 稳定性试验

分别制备对照品和供试品溶液，在0 h、4 h、8 h、12 h及24 h分别进样分析，测黄芪甲苷、黄芪皂苷Ⅱ及人参皂苷Rb2的峰面积，考察对照品和供试品溶液的稳定性。结果显示，对照品和供试品溶液在24h内人参皂苷Rb2与黄芪甲苷或黄芪皂苷Ⅱ峰面积比值基本稳定，人参皂苷Rb2与黄芪甲苷峰面积比值在对照品和供试品中的RSD分别为1.46%、2.12%，人参皂苷Rb2与黄芪皂苷Ⅱ峰面积比值在对照品和供试品中的RSD分别为0.97%、1.23%。

2.4 大孔树脂富集纯化黄芪皂苷

2.4.1 大孔树脂的预处理和装柱

分别称取AB-8、XDA-1及XDA-5大孔吸附树脂各3份，每份5 g，加入7～8倍量95%乙醇浸泡24 h，抽滤，倾去上浮物后以5 mL/h的流速湿法装柱(柱高25 cm)，接着用95%乙醇淋洗，直至流出的溶液与3倍水混合后未见白色浑浊，停止乙醇淋洗，最后以纯化水洗净至无醇味，浸泡备用。

2.4.2 黄芪提取液

取“2.2.2”项下干燥的黄芪粉末20 g，以70%乙醇200 mL加热回流提取3次，每次1 h，合并提取液，水浴浓缩浸膏至无醇味，加入蒸馏水搅拌并定容至200 mL，冷却后抽滤得澄清液，即得。

2.4.3 不同型号的大孔树脂吸附容量的确定

取“2.4.2”项下的黄芪提取液20 mL上柱，预吸附1 h，流出液重吸附1次，每20 mL收集一份，不同型号得大孔树脂各平行3份。将样品转移至蒸发皿中并挥干，加甲醇定容到100 mL容量瓶中，用0.22 μm微孔滤膜过滤，分别精密吸取上述溶液及人参皂苷Rb2内标物溶液各1.0 mL，摇匀，再按HPLC-ELSD法测定黄芪甲苷及黄芪皂苷Ⅱ的总量，计算吸附容量，吸附容量=(上住液中两种皂苷总量-过柱液中两种皂苷总量)/干树脂含量，结果见表2。

表2 吸附容量Table 2 Adsorptive capacity

由表2可见，AB-8型大孔吸附树脂对黄芪两种皂苷的富集作用更加明显，故选择该型号树脂进行吸附。

2.4.4 洗脱溶媒的选择

称取AB-8型大孔树脂20 g，按照“2.4.1”项进行预处理和装柱。取黄芪提取液40 mL上柱，用200 mL蒸馏水洗脱水溶性杂质，再继以30%乙醇、50%乙醇及70%乙醇各200 mL进行洗脱。不同比例的乙醇洗脱液每50 mL收集1份，挥干并用甲醇定容至100 mL，过滤后加入内标物，再以之前拟定的色谱条件进样分析。以收集得洗脱液编号(X)为横坐标，以计算所得的两种皂苷总量(Y)为纵坐标绘制洗脱曲线，见图2。

图2 梯度洗脱曲线Fig.2 Gradient elution curves

图2的结果显示，30%乙醇和50%乙醇对黄芪中两种皂苷的洗脱能力均较强，两种皂苷更多的集中在50%乙醇洗脱液中，占比达65.86%。而70%乙醇洗脱液中，两种皂苷总量仅为全部洗脱液的8.50%，占比很少。故确定洗脱条件为：蒸馏水洗脱水溶性杂质，继用50%乙醇洗脱黄芪中的皂苷成分，收集50%乙醇洗脱部分。

2.4.5 洗脱溶媒用量

选取“2.4.4”项下的大孔吸附树脂进行本项试验。吸取黄芪提取液40 mL上柱，蒸馏水的用量分别为100 mL(条件1)、150 mL(条件2)、200 mL(条件3)，再用200 mL的50%乙醇依次洗脱，洗脱液每50 mL收集一次，挥干过滤后按色谱条件测定乙醇洗脱液中的两种皂苷总量。结果三个条件下计算的两种皂苷总量(20 g生药中)分别为40.85 mg(条件1)、38.79 mg(条件2)、37.42 mg(条件3)，三者比较无显著性差异，条件1提取所得最高。分四段收集的乙醇洗脱液中，前100 mL中两种皂苷成分的洗脱率在83.76%左右，已收集大部分。故确定本次优化的最终条件为：吸取黄芪提取液40 mL上柱，100 mL蒸馏水洗脱水溶性杂质，继用100 mL 50%乙醇洗脱黄芪中的皂苷成分，收集50%乙醇洗脱部分。

3 结 论

3.1 检测器及流动相条件选择

黄芪中的主要成分包括多糖、黄酮和皂苷，黄芪甲苷及黄芪皂苷Ⅱ在紫外末端只有弱吸收，故采用传统紫外检测器无法精确测定两种皂苷成分的含量。ELSD是一种通用型检测器，尤其适合于几乎没有紫外吸收的皂苷类化合物的测定，故本文选取该检测器对黄芪甲苷及黄芪皂苷Ⅱ进行含量测定。

在实验前，通过大量文献查阅发现，HPLC-ELSD法测定黄芪皂苷类成分时，选择的流动相包括甲醇-水、乙腈-水和乙腈-酸水溶液三种洗脱系统，经多次考察验证，乙腈-酸水溶液系统的基线噪音肖，色谱峰的分离度和拖尾均由于其他两种系统。为避免酸性对色谱柱的损害，保护色谱柱，需尽量降低酸的浓度，但过低会影响色谱峰灵敏度。我们选择0.3%、0.2%及0.1%的冰醋酸及甲酸溶液进行试验，试验结果显示，使用0.2%的冰醋酸溶液作为流动相可在较低的酸浓度下获得不错的色谱峰灵敏度，故本实验最终选取0.2%冰醋酸-乙腈作为流动相。

3.2 人参皂苷Rb2作为内标物

通过观察黄芪甲苷和黄芪皂苷Ⅱ的结构发现，人参皂苷类成分与两者的结构类似，且黄芪中不含油人参皂苷类成分。对比观察人参皂苷Rb2、人参皂苷Rb1及人参皂苷Rb3作为内标物时，供试品中各色谱峰的分离度，结果人参皂苷Rb2与黄芪中两种皂苷成分的分离度良好，出峰位置无干扰，且出峰时间较为接近，是理想的内标物。